CIK细胞治疗恩替卡韦治疗e抗原阳性乙型肝炎患者的治疗观察

CIK细胞治疗恩替卡韦治疗e抗原阳性乙型肝炎患者的治疗观察

李哲王瑶

哈尔滨市传染病院黑龙江哈尔滨150036

摘要：目的自体细胞因子诱导杀伤（cytokine-inducedkiller，CIK）细胞治疗慢性乙型肝炎的疗效及安全性。方法31例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，分为治疗组15例和对照组16例，治疗组在初始予以口服恩替卡韦分散片0.5mg/d.4周基础上，采集这15例e抗原阳性的慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞，在体外经干扰素γ白细胞介素-2、抗CD3单克隆抗体抗体等细胞因子诱导成CIK细胞，分次自体回输；对照组单用恩替卡韦分散片0.5mg/d.4周为入组条件；在第12W观察其HBsAg定量、HBV-DNA水平、e抗原血清转换率进行比较分析，同时对不良反应和肾功能进行评估。结果治疗组CIK细胞均诱导成功，在治疗过程中除回输时一小部分患者出现一过性发热外，无其他明显不良反应，肾功能和血细胞无异常变化；治疗组与对照组进行了比较HBV-DNA水平为P=0.03，HBsAg定量为P=0.003，e抗原血清转换率P=0.004。结论接受恩替卡韦分散片治疗的患者联合应用CIK细胞治疗能显著降低患者血清HBsAg定量、HBV-DNA水平、e抗原血清转换率。

关键词：慢性乙型肝炎；自身细胞因子诱导的杀伤细胞治疗；恩替卡韦分散片；HBV-DNA水平；HBsAg定量；e抗原血清转换率；

1963年Blumberg教授发现澳大利亚抗原，从此揭开了HBV的神秘面纱，得益于上述里程碑式的发现，临床医师可以诊断HBV感染，并发明了乙肝疫苗，进而使全球乙型病毒性肝炎发病率大幅度下降。近年来，慢性乙型病毒性肝炎的发病机制不断得到更新与认识，抗HBV的药物也不断出现，然而无论是核苷类药物，还是干扰素（IFN），单纯的抗病毒治疗都无法彻底的清除病毒，只有极少数患者能够得到临床痊愈。HBV感染的控制和病毒的清除有赖于抗体的免疫系统，其感染慢性化与抗体特异性免疫（尤其是细胞免疫）功能低下密切相关，旨在通过增强或者恢复机体HBV特异性免疫功能，以控制和清除HBV感染的免疫治疗是被人们寄予厚望一种治疗策略备受关注。细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞1991年由美国斯坦福大学Schwidt-Wolf等首次报道，由于该类细胞具有非人类主要组织相容性复合体限制性、高增殖性、高细胞毒性以及细胞来源丰富等种种有点。以下为我院2014年10月~2015年10间收治e抗原阳性患者31例。

1.对象与方法

1.1研究对象选取2014年10月~2015年10月我院收治HBeAg阳性接受恩替卡韦分散片抗病毒治疗4周的慢性乙型肝炎患者31例。男性23例，女性8例，年龄18~60岁，诊断符合中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会2010年制度的《慢性乙型肝炎防治指南》：HBsAg阳性超过6个月，现HBsAg和HBV-DNA均阳性，入组标准：HBsAg、HBeAg、抗HBc阳性、HBV-DNA≥1.0×105U/ml，ALT为（2-10）×正常值上限（ULN），TBIL≤25μmol/L，12周内未接受过其他抗病毒药物，排除其他病毒性肝炎，肝硬化失代偿期，恶性肿瘤，自身免疫性疾病，精神疾病，非病毒性慢性肝病，妊娠和哺乳期妇女或存在其他严重疾病等。

1.2研究方案符合入组标准的HBeAg阳性，均口服恩替卡韦分散片（江苏正大天晴制药有限公司）4周基础上，治疗组联用CIK细胞2个疗程，CIK细胞的培养制备和回输方法，用成分血分离机采集患者外周血单个核细胞（1~4）×109个，在符合良好操作规范的GMP实验室条件下，在不同的时间加入一定剂量的重组人干扰素γ（200U/ml），白细胞介素（IL）-2和抗CD3单克隆抗体等各种细胞因子，37℃，5%CO2悬浮培养。分别为8d后和20d后每疗程将CIK细胞分3次每日回输给患者，每次的CIK细胞经离心、洗涤和重悬浮后以0.9%氯化钠注射液。细胞悬液回输给患者，细胞数＞1×109。

1.3观察指标治疗前后询问病史，进行系统体格的检查，并在治疗后第12周检测HBsAg定量，HBV-DNA水平、e抗原血清转换率。ELISA法（美国雅培公司I2000SR免疫发光检测系统）检测HBsAg、HbeAg、抗HBs、抗HBe。血清HBeAg＞250IU/ml，则采用1：20~1：：100稀释，并根据校准曲线读数。HBV-DNA采用（CAPICTM）检测系统（美国罗氏分子系统公司）

1.4统计学处理使用SPSS19.0统计软件进行数据分析，正态分布的计量资料以`X±S表示，两组比较采用t检验，非正态分布的计量资料以M（QR）表示。采用秩和检验，计数资料采用X2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1研究完成情况和基线特点

本研究共纳入31例患者，全部完成本研究，两组患者性别、年龄、病程、病毒学指标差异无统计学意义（P＞0.05），见表1

2.2CIK细胞培养过程中的质量控制

每例患者CIK细胞培养过程中均进行多次真菌、细菌和支原体检测，结果均为阳性，确保了细胞培养和回输的安全。

2.3CIK细胞回输后的不良反应

在CIK细胞的回输过程中及回输后，15例中有4例存在不同程度的低热，一般在回输后1-2h出现，持续时间为2-6小时，未采取任何措施自行缓解，15例患者均未出现其他不良反应，包括血常规和肾功能的异常变化。

2.4HBsAg水平、HBV-DNA水平、e抗原血清转换率的变化情况治疗组与对照组患者比较，治疗组HBsAg定量，HBV-DNA水平，抗原血清转换率均明显优于对照组差异有统计学意义，见表2

3.讨论

HBV是引起肝硬化及肝癌的主要病因之一。目前虽然抗病毒药物研究不断进展，但疗效仍不令人满意。过继免疫治疗是抗病毒治疗的主要方法之一。既往曾用淋巴因子，激活的杀伤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞治疗，由于很难同时获得既具有高活性又数量充足的效应细胞，应用受到限制。CIK细胞是经多种因子诱导的一群异质性细胞，可分为泌IL-2、IL-6、干扰素γ等多种细胞因子，通过多种途径激活机体免疫系统。提高机体的免疫功能。CIK细胞中的效应细胞，CD3+CD56+细胞在正常外周血中极为罕见，仅1%-5‰在体外经多种细胞因子培养，CD3+CD56+细胞迅速增多，可较培养前升高1000倍以上，CD3+CD8+细胞也可以培养前的20%上升到60%~80%。采用多因子激活免疗细胞的过继回输可以有效的抑制病毒的复制，有希望成为慢性乙肝的有效治疗手段。我们发现经自体CIK联合恩替卡韦分散片联合抗病毒的慢性乙型患者，可使免疫活化期患者HBV-DNA水平，HBsAg定量。e抗原血清转换率明显好转。自体免疫细胞治疗慢性乙型肝炎有很好的应用前景，但治疗方案仍无定论，对接受免疗细胞治疗的时机，疗程，怎样与抗病毒药物联合应用才能发挥最佳治疗等问题仍需要进行大量深入的研究。

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