免疫磁珠联合巢式PCR检测非小细胞肺癌患者手术前后外周血微转移的预后价值

免疫磁珠联合巢式PCR检测非小细胞肺癌患者手术前后外周血微转移的预后价值

黄同海王正林少霖杨林

黄同海王正林少霖杨林(暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院胸外科518020)

【摘要】目的探讨利用免疫磁珠富集技术联合巢式RT-PCR。方法检测非小细胞肺癌患者(NSCLC)手术前后外周血微转移的预后价值。方法应用免疫磁珠联合巢式LUNX-mRNART-PCR检测80例NSCLC患者手术前后外周血微转移，研究其与临床和病理特征的相关性和预后价值。结果手术前和手术后，LUNX表达阳性率分别为41例（51.3%）和28例（35.0%）；手术前LUNX表达阳性率与病理分期有关。手术后LUNX表达阳性率与病理分期、病理类型、体重减轻和KPS评分有关。手术前LUNX表达阳性和阴性患者的4年生存率分别为26.8%和35.9%；手术后LUNX表达阳性和阴性患者的4年生存率分别为17.8%和38.5%；多因素分析显示，手术后LUNX表达阳性是一独立不良预后因素。结论免疫磁珠富集技术联合巢式RT-PCR方法是检测NSCLC患者外周血微转移的敏感方法，手术后检测微转移有预后价值；微转移阴性患者比阳性患者预后好

【关键词】肺肿瘤免疫磁珠巢式PCR微转移预后

【中图分类号】R730.4【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）12-0009-03

DetectionandprognosticsignificanceofmicrometastasisinpreoperativeandpostoperativeperipheralbloodofNSCLCpatientsbyimmunomagneticbeadsandnestedPCR

HUANGTonghai,WANGZheng,LINShaolin,YANGLin,QIUPing,QIAOKun.

DepartmentofThoracicSurgery,ShenzhenPeople’sHospital,The2ndClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Shenzhen518020,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheclinicalsignificanceofdetectingmicrometastasisinpreoperativeandpostoperativeperipheralbloodofNSCLCpatientsbyimmunomagneticbeadsandnestedPCR.MethodsPeripheralbloodwastakenfrom80NSCLCpatientsbeforeandafteroperation.LUNX-mRNAoftheperipheralbloodwasdetectedbyimmunomagneticbeadsandnestedPCRandboththeirrelationshipwithclinicopathologicalfeaturesandprognosticsignificancewerefurtherinvestigated.ResultsThepositiveratesofLUNX-mRNAwere51.3﹪and35.0﹪,respectively,beforeandafteroperation.ThepositiveratesofLUNX-mRNAbeforeoperationwerecloselyincorrelationwithTNMstage.Incontrast,itturnedouttobemorecloselyrelatedwithhistologicaltypes,weightloss,KPSstatusaswellasTNMstageafteroperation.The4-yroverallsurvivalrateforpreoperativeLUNX-positiveand-negativepatientswere26.8﹪and35.9﹪,respectively,whileforpostoperativeLUNX-positiveand-negativepatientswere17.8﹪and38.5﹪,respectively.MultivariateanalysisshowedthatthepostoperativeLUNX-positivewasanindependentunfavorableprognosticfactor.ConclusionImmunomagneticbeadsandnestedPCRwereasensitivemethodtodetectmicrometastasisinperipheralbloodofNSCLCpatients.Detectionofmicrometastasisinpostoperativeperipheralbloodmaypossessaprognosticsignificance.Micrometastasis-negativepatientshavebetterprognosiscomparedtothosewithmicrometastasis-positivepatients.

【Subjectwords】LungneoplasmsImmunomagneticbeadsMicrometastasisNestedPCRPrognosis

肺癌根治术是目前肺癌主要治疗手段之一，但术后五年生存率仍然较低，肺癌治疗失败的主要原因是术后的复发和转移。因此，早期诊断和治疗肺癌微转移是提高肺癌治疗率、改善患者预后的有效途径[1]。最近新出现的纳米免疫磁珠富集技术具有靶向特异性强、操作方便、分离高效、对细胞无损伤等优点，为肿瘤患者微转移的诊断提供了一种新方法。PCR技术具有较高的灵敏度，可从107个单个核细胞中检测出一个肿瘤细胞，是目前检测实体瘤外周血中微转移最普遍的方法。本文应用免疫磁珠富集技术联合巢式RT-PCR方法检测NSCLC患者手术前后外周血LUNX-mRNA的表达，以探讨其与临床病理特征的相关性和预后价值。

1材料与方法

1.1研究对象:2008年1月至2008年12月我院胸外科收治的原发性NSCLC患者80例，其中男性44例，女性36例，年龄32～74岁，平均年龄50.1岁。Ⅰ期16例，Ⅱ期35例，ⅢA期29例；腺癌41例，非腺癌39例。标本均为外周血。

1.2主要仪器和试剂:免疫磁珠试剂盒购自德国MiltenyiBiotec公司，台式高速冷冻离心机购自日本Hitachi公司，BeckmanDU-650spectrophotometer可见紫外分光光度计（USA）、AppliedBiosystemsGeneampPCRSystem9700PCR仪（USA）、TOMYMRX-152微量高速冷冻离心机（Japan）、Bio-RadGelDoc2000GelDocumentationSystem凝胶成像及分析系统（USA）。Trizol购自美国MRC公司，RobusTIRT-PCRKit购自Finnzymes(Finland)，PCRMarker、琼脂糖购自MBI公司。

1.3引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。LUNXmRNA外引物：5’-GGGCCTCATTGTCTTCTACGGG-3’,5’-GAATGGGTGCAGTCACCAAGGAC-3’；内引物：5’-CTCATTGTCTTCTACGGGCTGTTAG-3’,5’-CTTTATGCCGAGAGGGATGGT-3’。扩增产物396bp。GAPDHmRNA外引物：5’-TCCATGACAACTTTGGTATC-3’；内引物：5’-TTCAGCTCAGGGATGACCTTG-3’。扩增产物183bp。

1.4方法

1.4.1标本采集：术前一天、术后第七天抽血，每个入组患者每次标本采集时间点抽取10ml外周静脉血。

1.4.2免疫磁珠富集分选：按免疫磁珠试剂盒说明书富集分离外周血标本中的肿瘤细胞。富集分选结束后，将分选柱移出磁场，加入1mlBSA，加压冲洗柱子，得到分选的肿瘤细胞。

1.4.3总RNA的提取按总RNA提取试剂盒说明书提取标本的总RNA。取5µl提取的总RNA电泳观察28S和18S亮带，以鉴定RNA提取质量，分光光度计定量，若OD260/OD280为1.7～2.0及电泳带28S:18S约2:1，表明所提取的RNA符合要求。

1.4.4巢式RT-PCR检测按FinnzymesRT-PCR试剂盒说明书进行。RT的反应体系为20µl，反应条件为：37℃2h，95℃5min。两轮PCR地反应体系均为50µl，扩增在PCR仪中进行，两轮的扩增条件相同，均为：95℃预变性5min。继之35个扩增循环，循环参数为94℃45s、58℃30s、72℃60s，最后经72℃延伸8min。

1.4.5琼脂糖电泳检测取5µl第二轮产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，经EB染色，在1×TBE缓冲液里，100V，30min。用Bio-RadGelDoc2000GelDocumentationSystem凝胶成像及分析系统成像来判断检测物的有无。

1.5随访及统计学处理：全部患者均进行随访，末次随访时间为2013年1月，中位随访时间48个月。观察指标包括生存期、总生存率、远处转移率、局部控制率。组间比较采用SPSS15.0统计学软件进行组间x2检验，Kaplan-Meier进行总生存率、远处转移率和局部控制率的估计，Log-rank检验组间差异，Cox风险比例回归模型行多因素分析。P＜0.05表示有统计学意义。

2结果

2.1手术前后检测结果的比较：LUNX和GAPDH电泳结果见图1。80例患者中，手术前有41例LUNX-mRNA表达阳性，手术后有28例LUNX-mRNA表达阳性。手术前41例LUNX-mRNA表达阳性患者中，手术后21例转为阴性，20例持续阳性；39例阴性患者，8例转变为阳性，31例持续阴性。

M为marker,1为阳性对照,2为

空白对照,3-8为患者PCR结果

图1部分肺癌患者术后外周血LUNXmRNA的表达

2.2LUNX表达阳性与临床病理特征的关系：手术前，LUNX表达阳性与患者病理分期有关(P＜0.05)；手术后，LUNX表达阳性与肺癌病理分期、病理类型、体重减轻、KPS评分有密切关系(P＜0.05)。

2.3LUNX表达阳性与远处转移和局部复发的关系：80例患者的4年总远处转移率和局部复发率分别为79.1%和73.6%，手术前LUNX表达阳性和阴性患者4年远处转移率分别为76.8%和71.4%，差异无统计学意义，而手术后分别为100%和63.4%，差异有统计学意义；微转移持续阳性、持续阴性、阳转阴和阴转阳的4年远处转移率，差异亦有统计学意义。

2.4LUNX表达阳性与预后的关系：80例患者的4年总生存率为31.3%。手术前后LUNX表达阳性与阴性患者的生存差异无统计学意义；而手术后差异有统计学意义，手术前持续阳性、持续阴性、阳转阴和阴转阳患者的生存差异也有统计学意义。多因素分析显示，手术后LUNX表达阳性是一独立的不良预后指标。

3讨论

微转移是指恶性肿瘤细胞发展过程中，播散并存活于血液循环、淋巴道、骨髓及各种组织器官中的肿瘤细胞，且无任何临床表现，常规影象学、病理学等方法难以检测到的微小转移。大量研究表明微转移是影响患者预后的重要因素[2]。

近年来随着纳米技术的不断发展，纳米免疫磁珠的诞生为肿瘤细胞生物诊断提供了先进的分离手段。免疫磁性分离是基于细胞表面抗原以及某种蛋白与连有免疫磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场的条件下，通过抗体与免疫磁珠相连的细胞和某种蛋白被吸附而滞留在磁场中，由于免疫磁珠表面的单抗只结合含有特异性抗原的细胞和蛋白，从而达到与其他种类的细胞和蛋白相分离的目的。此种分离技术将抗原抗体反应的高度特异性和免疫磁珠的富集分离作用相结合，达到特异性的生物活性物质和细胞的富集和分离效果，使其在临床医学诊断上具有广阔的应用前景。PCR方法是检测微转移最普遍的方法。该方法可在106-107个正常细胞中检测出一个肿瘤细胞，与光学显微镜检测（102-103个正常细胞中发现一个肿瘤细胞）和免疫组织化学方法（104-105个正常细胞中发现一个肿瘤细胞）相比具有更高的敏感性[3]。联合应用免疫磁珠和巢式RT-PCR方法检测外周血微转移，是将免疫磁珠的特异性富集分离作用和巢式RT-PCR的高灵敏度相结合，从而提高了检测外周血肿瘤细胞的检出率。

LUNX是Iwao等[4]2001年通过mRNA差异显示技术首次分离到的一个新的人类肺组织特异性基因。全长cDNA由1015个核苷酸组成，编码257个氨基酸，分子量为26.7kDa的蛋白质。Iwao等用LUNXmRNART-PCR检测了NSCLC肺癌患者手术切除淋巴结的微转移，结果表明该方法具有很高的敏感性和特异性。Michael等[5]运用实时定量PCR方法检测了24例I-IV期NSCLC患者外周血6种肿瘤相关基因（LUNX、MUC1、KS1/4、CEA、CK19、PSE）表达，结果表明LUNX是一种更优越的分子标记物。

有关NSCLC患者手术前后外周血微转移与预后报道较少。Yamashita等[6]的文献显示103例行手术的Ⅰ-Ⅲa期NSCLC患者，术前外周血微转移阳性者生存期较阴性短，而术后阳性者生存期最短，多因素分析显示手术前外周血微转移阳性是一独立预后指标。夏雪梅等[7]对NSCLC患者随访1～40个月，LUNXmRNA阳性的患者总体生存期明显低于阴性者。本研究结果显示手术前后LUNX表达阳性与阴性患者的生存差异无统计学意义；而手术后差异有统计学意义，手术前持续阳性、持续阴性、阳转阴和阴转阳患者的生存差异也有统计学意义。多因素分析显示，手术后LUNX表达阳性是一独立的不良预后指标。上述结果与近年来文献报道相似。

总之，研究结果表明，免疫磁珠富集技术联合巢式RT-PCR方法是检测NSCLC患者外周血微转移的敏感方法。手术后检测微转移有预后价值，并对治疗有潜在指导意义，微转移阳性的患者易发生远处转移，对这些患者加强术后辅助治疗是非常必要的。

参考文献

[1]MohajeriG,SaneiMH,TabatabaeeSA,etal.Micrometastasisinnon-small-celllungcancer:Detectionandstaging[J].AnnThoracMed.2012,7(3):149-152.

[2]YoungR,PaillerE,BilliotF,etal.Circulatingtumorcellsinlungcancer[J].ActaCytol.2012,56(6):655-660.

[3]SchülerF,DölkenG.Detectionandmonitoringofminimalresidualdiseasebyquantitativereal-timePCR[J].ClinChimActa,2006,363(1-2):147-156.

[4]IwaoK,WatanabeT,FujiwaraY,etal.Isolationofanovelhumanlung-specificgene,LUNX,apotentialmolecularmarkerfordetectionofmicrometastasisinnon-small-celllungcancer[J].IntJCancer,2001,91(4):433-437.

[5]MitasM,HooverL,SilvestriG,etal.Lunxisasuperiormolecularmarkerfordetectionofnon-smalllungcellcancerinperipheralblood[J].JMolDiagn,2003,5(4):237-242.

[6]YamashitaJ,MatsuoA,KurusuY,etal.Preoperativeevidenceofcirculatingtumorcellsbymeansofreversetranscriptase-polymerasechainreactionforcarcinoembryonicantigenmessengerRNAisanindependentpredictorofsurvivalinnon-smallcelllungcancer:aprospectivestudy[J].JThoracCardiovascSurg.2002,124(2):299-305.

[7]夏雪梅,赵福友,陈余清,等.非小细胞肺癌外周血LunxmRNA检测及其对微转移诊断和预后判断的意义[J].蚌埠医学院学报,2010,35(4):355-357.

基金项目:2008年深圳市科技计划项目(200802099)