Netrin-1在耐药性颞叶癫痫患者脑组织中的表达及意义

Netrin-1在耐药性颞叶癫痫患者脑组织中的表达及意义

沈兰1?王学峰2唐月岭1车福友1谢刚

沈兰1?王学峰2唐月岭1车福友1谢刚11.重庆市江津区中心医院神经内科重庆402260；2.重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆400016

【摘要…目的研究神经导向因子（Netrin-1）在耐药性颞叶癫痫患者脑组织中的表达，探索其在耐药性癫痫发病及演变机制中的意义。

方法按随机化原则从我们建立的耐药性癫痫患者术后脑组织库中随机抽取32例耐药性颞叶癫痫患者术后脑组织标本，用免疫组化法检测Netrin-1在耐药性颞叶癫痫患者脑组织中的表达，并与对照组进行比较。结果通过免疫组化，实验组与对照组平均光密度值（OD）的定量分析结果分别为0.5304±0.06320、0.2018±0.03024，两组比较，差异有显著性（P<O．05）。结论Netrin-1在耐药性颞叶癫痫患者脑组织表达增强，提示其参与了耐药性癫痫的形成。

【关键词…耐药性颞叶癫痫；神经导向因子（Netrin-1）；免疫组化【中图分类号…R363.2+71【文献标识码…A【文章编号…1276-7808（2015）-04-007-02TheexpressionofNetrin-1inbrainofpatientswithintractabletemporalepilepsyLANSHEN1?XUEFENGWANG2YUELINGTANG1FUYOUCHE1GANGXIE11DepartmentofNeurology，JiangjinCentralHospital，Chongqing402260，China2DepartmentofNeurology，TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，ChinaAbstract：ObjectiveToinvestigateNetrin-1expressioninthebrianofpatientswithintractabletemporalepilepsyanddiscussthepossibleroleoftemporalepilepsy.Methods32casesofbraintissuesofintractableepilepsyand15casesofnonepilepticbraintissueswerecollected．TheexpressionofNetrin-1inthespecimensweredeterminedbyimmunohistochemistry.ResultsTheopticaldensity（OD）valueofimmunohistochemistryinepileptictissueofexperimentalgroupandthecontrolwere0.5304±0.06320and0.2018±0.03024，respectively，thedifferencewasstatisticallysignificant（P＜0.05）.ConclusionOurresultssuggestthatNetrin-1mayplayanimportantroleintheepileptogenicmechanismsofintractableepilepsy.KeywordsIntractableepilepsy；Netrin-1；ImmunohistochemistryNetrins

家族是在结构上种属间高度保守的细胞分泌型可溶性蛋白，是最先被认识的神经诱向因子，他们对轴突生长、神经细胞的定向迁移具有诱向作用，在神经系统的发育与再生中扮演了十分重要的角色[1]。

其经典成员之一的Netrin-1是对突变线虫缺陷unc-6基因进行基因分析而被发现，现称神经导向因子（neuralguidancefactor）[2]。Netrin-1在神经系统的多个部位表达，在胚胎神经发育中调控轴突生长、定向细胞迁移，在成年中枢神经损害后发挥抗凋亡、诱导细胞迁移、调节轴突方向形成等发挥作用[3]。目前研究发现神经组织的异常芽生、神经元网络的重组，是耐药性癫痫的主要病理特点。为了解Netrin-1与耐药性癫痫的相互关系和意义，我们采用免疫组化、双重免疫荧光的方法测定了其在耐药性颞叶癫痫患者脑组织中的蛋白表达，现报道如下：1.材料和方法1.1研究对象实验组：按随机化原则从药物难治性癫痫患者术后脑组织库中随机抽取32例脑标本组成本次的实验组，其中颞叶24例，海马8例。全部患者均系2004年～2005年在首都医科大学天坛医院、宣武医院、广东三九脑科医院、武汉新华医院神经外科就诊，行手术治疗的患者，有癫痫发作的典型表现和脑电图特征，发作类型符合国际抗癫痫联盟1981年有关癫痫发作分类的规定，并符合以下纳入标准：（1）用两种或两种以上一线抗癫痫药（卡马西平、丙戊酸、苯妥英钠、苯巴比妥）治疗，且血药浓度在有效范围内，发作次数与用药前比较没有明显减少；（2）头部CT、MRI及相关的实验室检查未发现颅内肿瘤或其它进行性神经系统疾病；（3）术前评估无手术禁忌证，术中脑电监测有明显的痫性放电灶，并能进行手术者；（4）患者本人及家属要求或同意手术治疗。其中男20例，女12例，年龄14岁～46岁，平均29.5±7.86岁；其中复杂部分性发作继发全身强直或阵挛或强直阵挛性发作者22例，有多种发作类型者10例（复杂部分性发作、单纯部分性继发复杂部分性、部分继发强直性或阵挛性发作）。对照组：对照组15例，系2004年～2005年在重庆市因交通意外或其它原因非正常死亡的健康人，其中男l2名，女3名，年龄13岁～52岁，平均（28.13±8.68）岁，研究标本中，11例取自颞叶，4例取自海马，并符合下列条件：（1）尸体解剖没有发现有中枢神经系统疾病；（2）家属同意，并签署知情同意书。标本的处理：将术中取出的脑组织一部分立即放人液氮罐（-80℃）中保存备用，另一部分立即置于4％多聚甲醛中固定24h（40℃），常规石蜡包埋，待检测用。

1.2免疫组化检测取出石蜡块，用石蜡切片机行连续冠状切片，片厚4μm，每个标本分别制备10张切片。随机抽取两张，其中一张做HE染色，以确定解剖部位；另一张作免疫组化检查。切片采用二甲苯和不同浓度的乙醇从高到低梯度脱蜡，滴加蒸馏水新鲜配制的3％H2O2，室温反应30min，以灭活内源性过氧化物酶；热修复（92℃～96℃，20min）抗原后，自然冷却至室温，滴加抗原修复液15min后，PBS洗片，滴加正常山羊血清封闭液，室温20min；甩去多余液体，不洗，加入一抗兔抗人Netrin-1（重庆百瑞生物工程有限责任公司1：50），4℃过夜，次日37℃孵育30min，PBS洗片3×5min，滴加生物素化二抗（鼠抗兔IgG），室温30min；PBS洗片，滴SABC（购自武汉博士德公司），室温20min；PBS洗片，DAB（试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司）显色15min，经苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。再从剩下的切片中任选1张用PBS液代替I抗进行染色，为阴性对照。研究结果用北航CM-2000B型生物医学图像分析系统分别对对照组和耐药性颞叶癫痫组海马及颞叶皮层切片进行图像分析，随机测定10个视野的光密度值，数据用均数±标准差（±s）表示。

1.3统计方法：所有数据采用SPSS19.0软件包进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间数据的比较采用t检验；计数资料采用百分率表示，比较采用卡方检验，统计水准为P=0.05。

2.结果我们对本次实验研究对象（实验组和对照组）的临床特点进行了比较，两组的年龄、性别等基本特征无显著差异（见表1）。

表1耐药性癫痫患者组与对照组临床基本特征比较

光镜下发现耐药性癫痫组和对照组神经元胞浆内均有棕黄色颗粒着色，主要位于神经元胞体和轴突。说明两组中均有Netrin-1的表达。但与对照组相比，Netrin-1蛋白在耐药性癫痫患者脑组织中的表达明显增强。由图1（A，B）可见实验组脑组织有明显深棕褐色的免疫反应产物，而对照组仅有轻微的着色。两组平均光密度值（OD）的定量分析结果（见图2）：实验组：0.5304±0.06320；对照组：0.2018±0.03024。采用SPSS19.0软件包进行数据统计学分析提示：耐药性癫痫患者脑组织Netrin-1的表达较对照组增高，两组间的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图2：为难治性癫痫组与正常对照组脑组织平均光密度值比较的直方图，（*）表示与对照组比较P＜0.05。

3．讨论在神经系统发育形成过程中，新生神经元的轴突要与靶区神经元建立突触联系进而形成正确神经网络系统是一个漫长而复杂的过程。

而发育中轴突的生长和导向是形成正常神经系统功能的前提和保证，相反，若轴突发育异常就会导致多种神经系统疾病，如智力障碍，癫痫等。王学峰[4]等人在颞叶内侧癫痫患者手术切片中发现海马齿状回细胞有明显的伸入外分子层的苔癣纤维芽孢形成，这些异常芽生与局部神经元形成了新的环路，导致神经元网络重组，产生异常的自我兴奋，从而成为癫痫易感性增加和反复发作的基础，这种异常的神经网络重组还可改变癫痫样放电传播的径路，使其绕过一些药物作用的重要位点，导致耐药性的产生[5]。

Netrin家族已被研究证实为一种存在于发育中神经系统内的分泌蛋白，它具有刺激轴突生长和在特定的区域诱导生长中轴突转向的作用[6]。

Netrin-1是可分泌蛋白，它作用于生长锥所表达的不同受体对细胞突起的生长起吸引或排斥作用，以达到调控突起生长方向的作用，已有研究证实，神经轴突诱向Netrin-1在癫痫后苔藓纤维出芽和突触重组过程中起着重要的作用[7，8]。在Lin等[9]人的研究中，他们运用Timm染色观察了苔藓纤维出芽与Netrin-1表达的关系，证实Netrin-1表达的时空顺序和海马苔藓纤维出芽相一致。在本实验中，我们观察到Netrin-1在耐药性癫痫患者脑组织中的表达比对照组高，说明在耐药性癫痫患者脑组织中突起的导向因子表达较多，促进病变脑组织异常芽生，产生异常神经网络回路，提示Netrin-1可能在耐药性癫痫形成机制中发挥了一定的作用。由此我们推测：在耐药性癫痫患者脑组织中，反复癫痫发作导致苔藓纤维出芽病理改变，轴突导向因子Netrin-1蛋白水平表达增加，吸引芽生苔藓纤维生长及定向，形成异常的突触联系，重建大脑神经网络，导致大脑兴奋性增加，最终形成耐药性癫痫。

参考文献：[1]SerafiniT，KennedyTE，GalkoMJ，eta1．Thenetrinsdefineafamilyofaxonoutgrowth-promotingproteinshomologoustoC.elegansUNC-6[J]．Cell，1994，78（3）409-424．[2]BakerKA，MooreSW，JarjourAA，etal.Whenadiffusibleaxonguidancecuestopsdiffusing：rolesfornetrinsinadhesionandmorphogenesis[J].CurrOpinNeurobiol，2006，16（5）：529-534.[3]SerafiniT，ColamarinoSA，LeonardoED，etal.Netrin-1isrequiredforcommissuralaxonguidanceinthedevelopingvertebratenervoussystem[J].Cell，1996，87（6）：1001-1014．[4]王学峰.难治性癫痫：概念、组成、发病机制研究[J].当代医学，2001（12）：43-47.[5]王学峰.耐药性癫痫的发病机制及治疗进展[J].中国医师进修杂志，2007，30（7）：7-10.[6]KennedyTE，SerafiniT，delaTorreJR，eta1．Netrinsarediffusiblechemotropicfactorsforcommissuralaxonsintheembryonicspinalcord[J]．Cel1．1994，78（3）：425-435．[7]余璐，郑金瓯.轴突导向分子和癫痫后海马重构[J].国际神经病学神经外科学杂志，2005，32（5）：467-471.[8]MuramatsuR，NakaharaS，IchikawaJ，etal.Theratioof'deletedincolorectalcancer'to'uncoordinated-5A'netrin-1receptorsonthegrowthconeregulatesmossyfibredirectionality[J].Brain，2010，133（Pt1）：60-75.[9]Lin，H.，L.W.Wu，etal.Correlationbetweenhippocampalmossyfibersproutingandsynapticreorganizationandmechanismsoftemporallobeepilepsy[J].ZhonghuaYiXueZaZhi，2007，87（5）：341-4.☆重庆市自然科学基金（cstcjjA10068）?通讯作者：沈兰