无菌枸橼酸细菌内毒素检查方法的研究

无菌枸橼酸细菌内毒素检查方法的研究

于欣

哈药集团制药总厂150000

【摘要】本文对无菌枸橼酸细菌内毒素的检查方法进行研究，希望能够建立无菌枸橼酸细菌内毒素的检验方法，本文根据英国药典规定的无菌枸橼酸细菌内毒素限值，来制定更加精准的细菌内霉素检测方法，按照药典关于细菌内霉素的检查法来进行试验，对检测的结果进行判断，采用PH调节法和供试品稀释法来对其进行实验，通过进一步的检测来证明建立细菌内霉素检测的可行性，对无菌枸橼酸细菌内毒素的质量进行控制。

【关键词】无菌枸橼酸、细菌内毒素

无菌枸橼酸是磷霉素钠粉针剂的一种重要辅料。到现在为止，在我国国内对无菌枸橼酸仍旧没有一个明确的标准，现在我国所有使用无菌枸橼酸来进行生产的企业，基本都是通过无菌粉的通用规则来进行生产鉴定的，对无菌枸橼酸进行处理，也是采用普通的药用标准来进行的，让其的热原项指标能够符合无菌粉针的标准，满足无菌粉针的无菌指标要求。无菌枸橼酸的酸性相对来讲也比较强，在进行热原法检测的时候，经常会出现实验兔非正常死亡的现象，让实验结果的准确性和客观性得不到保证。

本文通过对无菌枸橼酸进行干扰实验，来用细菌内霉素检查代替原本的热原检查法，近几年来药用辅料的运用越来越广泛了，药用辅料不仅可以让药剂的稳定性得更好地保持，还可以让药剂的质量得到更好地保证，让主药本身的不良反应被有效地降低，让药剂的生物利用度得到更好地提升等积极的作用。但是对于辅料在药品中应用的标准，我国现在仍旧没有一个非常统一的标准，在2010年对于《中国药典》进行增修的时候，对于国内的一些新型辅料标准和生产常用品，仍旧有很多需要完善的地方。完善注射剂药用辅料标准中的细菌内毒素检查项对临床用药安全具有重要意义。本文就注射剂常用pH值调节剂和稳定剂枸橼酸进行了细菌内毒素检查法的可行性研究，并建立其细菌内毒素检查法。考虑到枸橼酸的pH值偏酸，故将干扰试验分成稀释法及中和法两部分来进行。

1材料

TAL(批号：20061024；规格：0．5EU/ml；产地：湛江经济技术开发区海洋生物制品厂)；RSE(批号：2003—10；规格：200EU；产地：中国药品生物制品检定所)；BET(批号：0303070；灵敏度：0．5EU/ml；产地：安度斯生物有限公司)；无菌枸橼酸(批号：200603007、200603008、200603009；产地：东北制药总厂张士制药公司)。

2方法

2．1ETX限值

采用BP2000版规定的ETX限值，即L=.．5EU/mg。热原检查法采用本品的供试液C=25mg/ml，注射剂量2ml/kg，所以本品的ETX限值可表示为L=25EU/ml。《中国药典》中，该品种未收载细菌内毒素检查项。考虑到枸橼酸作为注射剂辅料，不同制剂所用的量不同，我们参照《英国药典》，将其细菌内毒素限值确定为L=0.5EU·mg－1。

2．2TAL灵敏度复核

根据鲎试剂灵敏度的标示值，用BET分别将WSE稀释成2.0，1.0，0.5，0.25λ4个浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管，同时用BET做2支阴性对照管。按下列计算鲎试剂灵敏度的测试值(λc):λc=log－1(ΣX/4);X为反应终点内毒素浓度的对数值。

2．3干扰试验

2．3．1干扰预试验

考虑到现市售鲎试剂分别为0.5，0.25，0.125，0.06，0.03EU·mL－1五个灵敏度。将批号为1110006的枸橼酸用BET进行稀释，使其终浓度分别为2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625mg·mL－1，将浓度为1，0.5，0.25，0.125，0.0625mg·mL－1系列溶液记为NPC;同时在浓度为2，1，0.5，0.25，0.125mg·mL－1溶液中添加等体积4λ浓度的内毒素溶液，使每一浓度试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，将此系列溶液记为PPC。取标示灵敏度为0.25EU·mL－1不同厂家的TAL试剂，分别与上述NPC和PPC溶液进行反应，每一浓度重复做2管。

2．3．2正式干扰试验

考虑到上述干扰预试验结果，使用灵敏度为0.03EU·mL－1的鲎试剂进行正式干扰试验。

将枸橼酸用BET稀释至终浓度为0.125mg·mL－1的溶液(供试品阴性对照液)。分别将WSE配成浓度为0.06，0.03，0.015，0.0075EU·mL－1的含供试品(浓度为0.125mg·mL－1)及不含供试品的内毒素溶液，用湛江安度斯生物有限公司生产灵敏度为0.03EU·mL－1的TAL进行试验。将枸橼酸用BET稀释至终浓度为0.0625mg·mL－1的溶液(供试品阴性对照液)。分别将WSE配成浓度为0.06，0.03，0.015，0.0075EU·mL－1的含供试品(浓度为0.0625mg·mL－1)及不含供试品的内毒素溶液，用湛江博康海洋生物有限公司生产灵敏度为0.03EU·mL－1的TAL进行试验。

2．3．3供试品PC液的制备：用1—50供试品将RSE制成0．5、0．25、0．125、0．0625的4个浓度。

2．3．4PPC液的制备：将20支TAL溶液管排成5列，每列4管，将2．3．3中配制的四个浓度的溶液分别加入其中四列中，每一浓度加4管，每管加入0．1ml，另外1列管中各加入0．1ml浓度为1—50供试液作为阴性对照。同时制备ETX标准液。

2.3.5常规检验

取标示灵敏度为0.03EU·mL－1上述两个厂家的TAL试剂进行检验，用BET将WSE稀释成4λ，2λ(阳性对照溶液)浓度的溶液，再将四批枸橼酸用BET进行稀释，使其终浓度分别为0.12，0.06mg·mL－1的溶液，同时在浓度为0.12mg·mL－1的溶液中添加4λ的等体积标准内毒素溶液作为供试品阳性对照溶液，并设阳性和阴性对照。

3结果

3．1TAL灵敏度复核：(批号：20031024)入=0．5EU/ml

3．2干扰试验

本试验采用0.1m.t/L的氢氧化钠试液调节供试液的pH值在6.5～8.5的范围内。用1mol·L－1氢氧化钠调节样品的pH值至6.0，后用BET进行稀释，使其终浓度分别为2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625mg·mL－1，将浓度为1，0.5，0.25，0.125，0.0625mg·mL－1系列溶液记为NPC;同时在浓度为2，1，0.5，0.25，0.125mg·mL－1溶液中添加等体积4λ浓度的内毒素溶液，使每一浓度试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，将此系列溶液记为PPC。取标示灵敏度为0.25EU·mL－1不同厂家的TAL试剂，分别与上述NPC和PPC溶液进行反应，每一浓度重复做2管。

由预试验结果可初步判断:0.5mg·mL－1及以下浓度的枸橼酸对上述两个生产厂家的TAL与内毒素反应不存在干扰因素的影响。

2.4.2正式干扰试验将枸橼酸用1mol·L－1氢氧化钠调节样品的pH值至6.0，后用BET进行稀释至终浓度为0.5mg·mL－1的溶液(供试品阴性对照液)。分别将WSE配成浓度为0.5，0.25，0.125，0.0625EU·mL－1的含供试品(浓度为0.5mg·mL－1)及不含供试品的内毒素溶液，用上述两个生产厂家的灵敏度为0.25EU·mL－1的TAL进行试验。

4结论

综上所述，无菌枸橼酸是注射剂常用的一种稳定剂和PH值调节剂。对无菌枸橼酸进行细菌内毒素的研究，主要是为了保证细菌内霉素和热原符合规定要求。进行细菌内霉素的检测方法是非常简单的，相对来讲无菌枸橼酸重现性也会比较好，进行检测的准确值也非常的高，在进行实验的过程中需要同时运用PH调节法，以及供试品稀释的方法来对无菌枸橼酸进行实验，实验的结果证明，建立细菌内霉素检查的方法是可行的，在进行PH值调节剂来进行试验之后，还可以采用内霉素检查的方法，来对无菌枸橼酸的质量进行控制。

参考文献：

[1]乔立俊,李松梅,QiaoLijun,等.枸橼酸咖啡因注射液细菌内毒素检查法的可行性研究[J].基层医学论坛,2016(s1):38-40.

[2]刘秀兰,殷俊,陈胤忠,等.血液透析液细菌内毒素合格率影响因素[J].江苏预防医学,2016,27(2):236-237.

[3]张云平,陈启钊,ZhangYunping,等.建立血栓通冻干粉针细菌内毒素检查方法[J].医疗装备,2016,29(4):111-112.

[4]杨海燕.帕拉米韦注射液细菌内毒素检查法的研究[J].中国药事,2016,30(2):133-136.