山西中医药大学附属医院 肾病科 山西省太原市 030000
摘要:目的:测定青梅与乌梅中枸橼酸的含量,为综合评价乌梅青梅质量提供依据。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为COSMOSIL C18柱,流动相为乙腈:磷酸二氢铵水溶液(3:97);检测波长为210nm;流速为1mL/min;柱温为30℃。结果:建立了HPLC法测定枸橼酸含量的方法。对不同产地、不同批次的乌梅青梅进行含量分析。结论:HPLC法测定方法结果准确,峰形较好,可用于初步建立乌梅青梅的色谱图;含量测定结果表明,炮制前后乌梅青梅的枸橼酸并未发生较大变化。
关键词:乌梅;青梅;枸橼酸;高效液相色谱法
[Abstract] Objective: To determine the content of citrate in plum and ebony, and to provide a basis for comprehensive evaluation of plum quality. Methods: A high performance liquid chromatography (HPLC) was performed on a COSMOSIL C18 column using A acetonitrile-ammonium dihydrogen phosphate (PH3) as the mobile phase (isocratic); VA: VB = 3: 97; UV detection Detection wavelength of 210nm; flow rate of 1mL / min; column temperature of 30 ℃. Results: A method for the determination of citric acid by HPLC was established. Analysis of the content of different batches of different varieties of Wu Mei Qingmei. Conclusion: The HPLC method has the advantages of accurate and good peak shape, and can be used for the initial establishment of the chromatogram of Wumei and Qingmei plum. The results show that the citrate has not changed greatly before and after processing.
Key words:Wumei;Qingmei;Citric acid;HPLC
梅,是我国原产植物[1],距今已有三千余年的栽培历史。梅实、梅花及叶等均可药用。早在东汉,《神农本草经》中将梅果列为中品,“主下气,除热烦满,安心,肢体痛,偏枯不仁,死肌,去青黑痣、恶肉[2]。”梅果根据不同加工方法可制成青梅、白梅、乌梅[3],其中低温烘干者为青梅,用盐腌渍者为白梅,熏制或烘制至梅肉变黑者为乌梅。青梅多作为食用或作为调味品,药用有利咽,生津的功效。通过炮制后,乌梅的功效则发生改变,《中国药典》记载乌梅具有敛肺,涩肠,生津,安蛔之功,用于肺虚久咳,久泻久痢,虚热消渴,蛔厥呕吐腹痛[4]。目前研究认为乌梅中主要的活性成分为有机酸类化合物,其中以枸橼酸为主要活性成分。《中国药典》2015版中也以枸橼酸为含测指标。本实验以建立高效液相色谱法测定乌梅、青梅中有机酸的含量,以掌握市场上乌梅及青梅的总体质量,同时了解不同炮制品枸橼酸的含量变化情况。
1仪器与材料
1.1仪器与试剂
LC-16C高效液相色谱仪(日本岛津公司);PL601-S千分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);TG16-WS台式高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国默克密理博)。
乙腈(德国默克公司);甲醇(德国默克公司);乙醇(德国默克公司);磷酸(上海试剂有限公司);磷酸二氢铵(上海试剂有限公司);以上试剂均为色谱纯。
1.2样品
实验用乌梅、青梅购于安徽亳州药材市场,均经安徽中医药大学欧金梅副教授鉴定。
表1实验样品批次
编号 | 样品名 | 产地 |
18011 | 青梅 | 云南 |
18012 | 青梅 | 云南 |
18013 | 青梅 | 云南 |
18014 | 乌梅 | 云南 |
18015 | 乌梅 | 云南 |
18016 | 乌梅 | 云南 |
18017 | 乌梅 | 福建 |
18018 | 乌梅 | 福建 |
18019 | 乌梅 | 福建 |
18020 | 乌梅 | 四川 |
18021 | 乌梅 | 四川 |
18022 | 乌梅 | 四川 |
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称取枸橼酸对照品2mg,置于容量瓶中,用纯化水定容,制成每1ml含0.5mg的溶液,置于4℃冰箱保存。用时过0.45μm滤膜即得对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
取青梅乌梅药材适量,去核后粉碎(过40目筛),精密称取细粉0.2g,精密加入纯化水10ml,称定重量,水浴锅加热回流1小时,放冷,再称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,再10000rpm高速离心10min,取上清液过0.45μm滤膜即得供试品溶液。
2.3 色谱条件的筛选
2.3.1 检测波长的选择
乌梅,青梅中主要含有有机酸、黄酮、糖类、萜类、甾醇类等化学成分[2-15];综合多种化学成分的紫外吸收以及提取工艺的要求,确定选择检测波长为210nm。
2.3.2有机相的选择
本实验考察了甲醇和乙腈两种有机相,由于乙腈的洗脱能力较甲醇强,且对于乌梅、青梅中的脂溶性的物质溶解度大,综合考虑最终选择乙腈作为流动相的有机相。
2.3.3 流动相比例的选择
本实验考察了0.3%,0.4%,0.5%三种磷酸二氢铵的比例,结果发现采用乙腈-磷酸二氢铵(0.5%)比例的流动相指纹图谱效果良好,故选择乙腈-磷酸二氢铵(0.5%)系统作为流动相。
2.3.4 洗脱梯度的选择
根据查阅文献以及多次实验的优化,最终选择等度洗脱。
2.3.5 柱温的选择
本实验对28℃、30℃、32℃三个柱温条件下的色谱图进行比较,结果表明在30℃条件下色谱图效果较好。
2.3.6 流速的选择
本实验对0.6mL/min、0.8mL/min、1mL/min三种流速条件下色谱图进行比较,结果表明1mL/min流速下色谱峰效果较好。
因此,色谱条件确定为:进样量:20μL;流动相:乙腈-0.5%磷酸二氢铵(3:97);检测波长:210nm;柱温:30℃;时间:8min;流速:1mL/min;
3对照品图谱及标准曲线方程
图1 枸橼酸对照品
标准曲线的建立:准确称量枸橼酸对照品5mg,溶于4ml纯化水中,用移液枪吸取200μL分别溶于1ml,2ml,3ml,4ml,5ml的纯化水中,做成浓度分别为1.25mg/ml,0.65mg/ml,0.41mg/ml,0.3125mg/ml,0.05mg/ml的梯度对照品溶液,注入色谱柱中,每个平行进样3次,以进样浓度(mg/ml)为横坐标,以3次峰面积平均值(Y)为纵坐标,进行线性回归,枸橼酸成分的回归方程、线性范围:即标准曲线方程为:y=231802x+119716 r=0.9992
4 样品图谱
图2 乌梅典型色谱图
图3 青梅典型色谱图
5方法与结果
5.1 精密度试验
取供试品溶液连续进样5次,测得210nm吸收波长下色谱图,得枸缘酸峰面积的精密度结果RSD为2.9%,表明精密度良好。
5.2 干扰试验
在色谱条件不变的情况下,对比乌梅青梅各个样品峰可知各峰间的分辨清晰,经计算相邻两峰间的分离度R均大于1.5,因此说明本方法测定乌梅青梅中枸缘酸有机成分时无干扰,选择性很强。
5.3 稳定性试验
分别取乌梅青梅供试品溶液分别在0,2h,4h,8h,12h,24h下进样分析,以枸缘酸为参照峰,测得枸缘酸的进样峰面积RSD为1.9%和2.0%。
5.4 重复性试验
取供试品溶液制备方法平行处理5份样品,按2.2项下条件分别测定,以枸缘酸为参照峰,考察样品相对峰面积的RSD,得枸缘酸有机成分含量的RSD为1.9%,表明重复性良好。
5.5回收率试验
精确称量枸橼酸一定量,按2.1项下操作制备0.5mg/ml的储备液。再各分别精称已知含量的乌梅青梅粉末0.2g 5份,每份各加入2.0ml上述对照品溶液,按样品测定“2.2”项下操作制备10ml 供试液。在同样色谱条件,各吸取供试液20μL,计算回收率。枸橼酸5次回收率测定结果见下表。
表3 乌梅青梅中枸橼酸加样回收率(n=5)
样品 | 样品中含量 mg | 加入量 mg | 测得量 mg | 回收率 % | 平均值 % | RSD % |
18011 | 50.302 | 50.000 | 100.003 | 99.7 | 99.9 | 1.7 |
50.000 | 100.213 | 99.9 | ||||
50.000 | 100.561 | 100.2 | ||||
50.000 | 100.125 | 99.8 | ||||
50.000 | 100.297 | 99.9 | ||||
18012 | 58.904 | 60.000 | 118.886 | 99.9 | 99.8 | 0.7 |
60.000 | 118.755 | 99.8 | ||||
60.000 | 118.654 | 99.7 | ||||
60.000 | 118.951 | 100.0 | ||||
60.000 | 118.657 | 99.7 | ||||
18013 | 64.320 | 65.000 | 129.256 | 99.9 | 99.6 | 3.0 |
65.000 | 129.325 | 100.0 | ||||
65.000 | 129.654 | 100.2 | ||||
65.000 | 129.258 | 99.9 | ||||
65.000 | 129.548 | 100.1 | ||||
18014 | 51.095 | 55.000 | 106.087 | 99.9 | 100.06 | 0.3 |
55.000 | 106.058 | 99.9 | ||||
55.000 | 106.485 | 100.3 | ||||
55.000 | 106.459 | 100.3 | ||||
55.000 | 105.998 | 99.9 | ||||
18015 | 59.428 | 60.000 | 119.456 | 100.0 | 99.9 | 0.6 |
60.000 | 119.238 | 99.8 | ||||
60.000 | 119.352 | 99.9 | ||||
60.000 | 119.435 | 100.0 | ||||
60.000 | 119.253 | 99.8 | ||||
18016 | 47.655 | 50.000 | 97.561 | 99.9 | 99.6 | 2.5 |
50.000 | 97.258 | 99.5 | ||||
50.000 | 97.356 | 99.6 | ||||
50.000 | 97.143 | 99.4 | ||||
50.000 | 97.660 | 100.0 | ||||
18017 | 49.468 | 50.000 | 99.152 | 99.6 | 99.8 | 0.25 |
50.000 | 99.845 | 100.3 | ||||
50.000 | 99.356 | 99.8 | ||||
50.000 | 99.216 | 99.7 | ||||
50.000 | 99.152 | 99.7 | ||||
18018 | 48.655 | 50.000 | 98.623 | 99.9 | 99.7 | 1.3 |
50.000 | 98.425 | 99.7 | ||||
50.000 | 98.447 | 99.8 | ||||
50.000 | 98.191 | 99.5 | ||||
50.000 | 98.223 | 99.5 | ||||
18019 | 61.970 | 60.000 | 121.889 | 99.9 | 99.9 | 1.5 |
60.000 | 121.975 | 100.0 | ||||
60.000 | 121.951 | 99.9 | ||||
60.000 | 121.984 | 100.0 | ||||
60.000 | 121.899 | 99.9 | ||||
18020 | 58.564 | 60.000 | 118.561 | 99.9 | 99.8 | 0.1 |
60.000 | 118.457 | 99.9 | ||||
60.000 | 118.336 | 99.8 | ||||
60.000 | 118.256 | 99.7 | ||||
60.000 | 118.563 | 99.9 | ||||
18021 | 60.408 | 60.000 | 120.438 | 100.0 | 99.8 | 1.2 |
60.000 | 120.251 | 99.8 | ||||
60.000 | 120.135 | 99.7 | ||||
60.000 | 120.139 | 99.7 | ||||
60.000 | 120.406 | 99.9 | ||||
18022 | 45.926 | 50.000 | 95.745 | 99.8 | 99.8 | 0.3 |
50.000 | 95.845 | 99.9 | ||||
50.000 | 95.653 | 99.7 | ||||
50.000 | 95.659 | 99.7 | ||||
50.000 | 95.928 | 100.0 |
6不同产地中乌梅青梅的含量测定
分别取乌梅,青梅0.2g,其中每个样品各称取3份,精密称定,按“2.2”项下制备供试品溶液,依“2.2”项下测定方法注入高效液相色谱仪进样测定枸橼酸峰面积,代入标准曲线方程,计算各自枸橼酸的含量,测定结果见表。
表4 乌梅青梅中枸橼酸含量测定
NO. | 峰面积 | 枸橼酸含量% | 平均含量% |
18011 | 1285737 | 25.2 | 25.7 |
1316479 | 25.8 | ||
1328940 | 26.1 | ||
18012 | 1116354 | 21.5 | 21.3 |
1102155 | 21.2 | ||
1100654 | 21.2 | ||
18013 | 1620243 | 32.4 | 32.3 |
1610664 | 32.2 | ||
1611525 | 32.2 | ||
18014 | 1224415 | 23.8 | 24.9 |
1304103 | 25.5 | ||
1304901 | 25.6 | ||
18015 | 1478683 | 29.3 | 29.5 |
1497269 | 29.7 | ||
1488561 | 29.5 | ||
18016 | 1268083 | 24.8 | 24.0 |
1224375 | 23.8 | ||
1208638 | 23.5 | ||
18017 | 1516285 | 30.1 | 27.8 |
1266397 | 24.7 | ||
1449754 | 28.7 | ||
18018 | 1503766 | 29.9 | 29.7 |
1493448 | 29.6 | ||
1493576 | 29.7 | ||
18019 | 1148613 | 22.2 | 27.5 |
1485123 | 29.5 | ||
1556201 | 30.9 | ||
18020 | 1473272 | 29.2 | 29.2 |
1477251 | 29.3 | ||
1473970 | 29.2 | ||
18021 | 1522685 | 30.3 | 30.4 |
1519981 | 30.2 | ||
1554852 | 30.9 | ||
18022 | 1631120 | 32.6 | 30.1 |
1184289 | 22.9 | ||
1713194 | 34.8 |
实验结果表明,全部样品的枸橼酸含量均在21%以上,超出药典标准,所测得的样品均合格。
7讨论
乌梅青梅同属于蔷薇科植物梅的干燥近成熟果实,现代药理学研究显示乌梅主要功能为敛肺镇咳、安蛔、抗氧化等作用[1-4];青梅中有机酸可使人体肠道暂时呈酸性,可通过抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌预防胃肠道传染病[5-8];对腹泻和便秘具有双向调节作用[9, 10]。乌梅与青梅的功效有较大区别,多是因加工炮制过程中化学成分发生变化导致。本研究首先根据《中国药典》检测乌梅和青梅中枸橼酸的含量变化,在实验开始阶段,对于乌梅和青梅样品提取条件做了考查,经过不同浓度的乙醇水与纯化水作为溶剂进行提取试验的对比,发现提取效率基本相同。考虑到实验成本,最终确定提取溶剂为纯化水。为保证提取率,选取水浴锅回流时间为1h;离心转数10000rpm,离心时间为10min。
本研究结果显示:12批样品的枸橼酸含量均大于12%,均符合药典标准。然而产自四川的乌梅的枸橼酸含量略高于云南、福建,但未见明显统计学差异。从9批乌梅样品含测结果看到,炮制前后枸橼酸的含量并没有明显改变,说明对乌梅通过炮制不会影响其中的枸橼酸含量。而3批青梅样品检测发现枸橼酸的含量变化较明显,因此我们认为,单纯以枸橼酸这一成分作为乌梅和青梅的唯一检测指标不够全面,应加强对炮制前后梅化学成分的定量检测。
8结论
本研究采用高效液相色谱法(HPLC),经过提取条件、梯度洗脱条件等条件优化后,在保证分离度、准确度、精确性、重复性等HPLC研究方法考察后,检测不同炮制品梅中枸橼酸的含量。本研究结果说明HPLC是快速且经济的检测不同炮制品梅的研究方法,能为梅的研究提供坚实的技术基础。然而本研究仅检测了枸橼酸这单一成分,在今后研究中考虑多成分定量分析不同炮制品梅的化学成分,以期建立更客观更全面的综合评价体系。
参考文献
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