mCIM与eCIM联合试验对CRE产酶类型调查研究及CRE耐药特点分析

mCIM与eCIM联合试验对CRE产酶类型调查研究及CRE耐药特点分析

朱胜波  谢海连  唐健

柳州市中医医院（柳州市壮医医院）检验科，广西柳州，545026

摘要：目的 了解本院碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）的临床感染特点和耐药性，探讨改良碳青霉烯类失活法（mCIM）联合乙二胺四乙酸-碳青霉烯类失活法（eCIM）的临床应用，为有效防控院内感染和合理使用抗菌药物提供依据。方法 对分离自临床样本的非重复CRE的试验数据进行分析。另随机选取124株美罗培南敏感性降低[最小抑菌浓度（MIC）≥2 μg/mL]的CRE，联合mCIM与eCIM判断其产金属β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶的情况。结果 共检出747株CRE，以肺炎克雷伯菌为主（59.97%），分布科室广泛，其中呼吸内科重症监护室分别占51.67%和22.09%，感染部位多见于呼吸道（57.30%）。CRE对替加环素、米诺环素的耐药率较低（分别为4.2%、30.6%），对其他的抗菌药物的耐药率较高，尤其是对青霉素类、碳青霉烯类、含酶抑制剂类及头孢烯类抗菌药物的耐药率高于90%。随机选取的124株CRE中有110株产碳青霉烯酶，其中产金属β-内酰胺酶的CRE 91株。结论 CRE感染情况严峻，需加强管理，有效降低院内CRE感染率。eCIM联合mCIM检测成本低、操作简单，是一种经济、高效的表型筛选方法。

关键词：碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌；改良碳青霉烯类失活法；乙二胺四乙酸-碳青霉烯类失活法

随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的大量使用，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）的检出率逐年上升。2017年，美国临床实验室标准化协会将改良碳青霉烯类失活法（modified carbapenem inactivation method，mCIM）纳入操作指南；2018年，又引入乙二胺四乙酸-碳青霉烯类失活法（ethylenediaminetetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM），可与mCIM 联合使用，用于区分产金属β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。文献报道mCIM筛查碳青霉烯酶的敏感性比用改良Hodge试验高，mCIM与eCIM联合检测能更有效地筛查碳青霉烯酶，且可区分碳青霉烯酶类型，从而有效指导临床用药[1]。本研究回顾性分析柳州市中医医院2019—2023年CRE的临床分布和耐药情况，并随机选取124株CRE临床分离株，联合采用mCIM与eCIM进行检测，判断菌株产金属β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶的情况，为防控院内感染提供参考。

1 材料与方法

1.1菌株来源 

本研究菌株均来自柳州市中医医院2019～2023年临床分离的124株 CRE 。其中包括 59 株肺炎克雷伯菌、50 株大肠埃希菌、8 株阴沟肠杆菌、3 株产气肠杆菌、1 株产酸克雷伯菌、1 株弗劳地枸橼酸杆菌、1 株格高菲肠杆菌和 1 株扬格枸橼酸杆菌。全部菌株均用微生物分析仪进行鉴定及药物敏感性测试。所有菌株均采用干燥纸片法保存并存放于 -80℃冰箱保存备用。

1.2仪器和试剂 

生化鉴定及药敏试验使用由湖南长沙天地人生物科技有限公司生产的TDR 300B-Plus生化药敏鉴定仪及其配套的肠杆菌科细菌检测试剂盒。血琼脂平板培养基、MH培养基由广州市迪景微生物科技有限公司生产。美罗培南纸片由英国Oxoid生产。乙二胺四乙酸试剂、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB，杭州滨和微生物试剂有限公司）。

1.3方法

1.3.1 细菌培养和鉴定按照《全国临床检验操作规程》第4版进行操作。菌种鉴定及药敏试验采用湖南长沙天地人生物科技有限公司生产的TDR 300B-Plus生化药敏鉴定仪及其配套的肠杆菌科细菌检测试剂盒，按照说明书进行操作。按CLSI最新的标准判读药敏结果。质控菌株为大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853，来源于国家卫生健康委临床检验中心。

1.3.2 mCIM和eCIM 联合检测

将随机收集的124株CRE接种至血平板，于培养箱中培养18～24 h，每株菌株同时进行mCIM和eCIM试验，即每株菌株分别取2支含2 mL TSB肉汤试管，其中1支加入20 uL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸溶液并做好标记，用1 uL接种环取满环菌株加入各管肉汤，震荡混匀10～15 s后，每管中放入1张含10 ug美罗培南的无菌纸片，确保纸片完全浸入，（35±2）℃条件下孵育（240±15）min。孵育临近结束时立即用0.9%氯化钠溶液制备0.5麦氏浊度的大肠埃希菌（ATCC 25922）悬液，并涂布于M-H培养基，用10 uL接种环将美罗培南纸片从TSB肉汤中取出，取出时将纸片贴于试管内壁，轻轻按压以挤去纸片上多余水分，将同一菌株的mCIM与eCIM试验纸片贴于同一已涂布大肠埃希菌（ATCC 25922）的M-H培养基表面。孵育18～24 h后测量抑菌圈大小，以判断结果。判读标准参照美国临床实验室标准化协会2022年M100-S32文件标准。

1.4统计学方法

采用WHONET 5.6和EXCEL 2013软件对数据进行统计分析。

2 结果

2.1 菌种分布

2019-2023年共检出CRE菌株747株，其中肺炎克雷伯菌448株（59.97%），大肠埃希菌206株（27.58%）。见表1。

表1  CRE菌种分布及构成比

2.2 科室分布

检出的CRE科室分布以呼吸内科为主（386株，占51.67%）；其次是重症监护室（165株，占22.09%）。见表2。

表2  CRE科室分布及构成比

2.3 标本分布

CRE菌株的标本分布以支气管肺泡灌洗液为主（314株，占42.04%），其次是尿液（187株，占25.03%）和痰（114株，占15.26%）。见表3。

表3  CRE菌株的标本分布及构成比

2.4 CRE检出率

2019-2023年每年大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、所有的肠杆菌科细菌中耐碳青霉烯类抗菌药物的数量及检出率见表4。

表4 CRE菌株检出率

2.5 CRE的耐药性分析

对检出的747株CRE菌株对常见抗菌药物的耐药率分析，并将大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的耐药率与全部的CRE菌株进行比较。见表5。

表5 CRE对抗菌药物的耐药率（%）

2.6 mCIM与eCIM联合试验检测结果

随机收集的124株CRE中，110株mCIM试验阳性，即产碳青霉烯酶；其中91株eCIM实验阳性，即产金属β-内酰胺酶；19株eCIM试验阴性，即产丝氨酸酶。见表6。

表6  mCIM和eCIM联合试验检测结果

3 讨论

随着广谱抗菌药物使用的增多，肠杆菌科细菌的获得性耐药现象也越来越严重，细菌对抗菌药物素的耐药谱可以随抗菌药物选择性压力不同而有所不同。在肠杆菌科细菌中最常见的耐药机制有超广谱β-内酰胺酶、产头孢菌素(AmpC)酶、产碳青霉烯酶、产氨基糖苷钝化酶、DNA螺旋酶A(gryA)和拓扑异构酶IV亚单位C(parC)基因突变。碳青霉烯类抗菌药物是广谱β-内酰胺类药物，可用于治疗严重感染和多重耐药菌引起的感染，被视为“治疗革兰阴性菌感染的最后一道防线”，碳青霉烯类耐药是一个严重的临床和公共卫生问题。

本院2019-2023年检出的747株CRE以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为主，两者占总CRE的87.55%，其中。科室分布以呼吸内科和重症监护室为主，而标本以支气管肺泡灌洗液、尿液、痰为主，提示CRE主要见于呼吸道和尿道感染，与文献报道的科室分布[2]及标本分布[3]相近。

分别统计2019-2023年间每年度的耐碳青霉烯类大肠埃希菌（carbapenem-resistant Escherichia coli，CRECO）和耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的检出率，与全国细菌耐药监测网(China Antimicrbial Resistance Surveillance System.CARSS)同期数据

[4-6]比较，我院CRECO的检出率均高于全国及广西的数据；CRKP的检出率在2019-2021年度与广西的检出率相近，且低于全国的数据，但在2022年CRKP的检出率升至21.05%，高于全国耐药监测网“中国两网监测云”公布的全国及广西的数据，仅低于上海的26.5及北京的24.9%，提示本院CRE感染情况十分严峻，需加强管理、对CRE患者采取隔离等措施，有效降低院内CRE感染率。对CRE耐药性进行分析，可见CRECO对替加环素和阿米卡星的耐药率较低（分别为1.5%、23.9%），CRKP对替加环素和米诺环素的耐药率较低（分别为3.8%、21%），总CRE对替加环素、米诺环素的耐药率较低（分别为4.2%、30.6%），对其他的抗菌药物的耐药率较高，尤其是对青霉素类、碳青霉烯类、含酶抑制剂类及头孢烯类抗菌药物的耐药率高于90%。

有研究报道mCIM与eCIM 联合实验检测产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型的敏感性和特异性较高[7-8]。本研究中124株CRE菌株mCIM阳性110株，即产碳青霉烯酶菌株 110 株；eCIM阳性91株，阴性 19 株，即产金属β-内酰胺酶菌株 91株，产丝氨酸碳青霉烯酶菌株19 株。产金属β-内酰胺酶菌株检出比例高于其他研究报道[9-10]，说明我院CRE菌株以产金属β-内酰胺酶为主，临床治疗此类感染患者可选择联合用药进行治疗[11]。因此，开展mCIM与eCIM 联合实验检测产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型对临床治疗具有很好的指导作用。

mCIM与eCIM 联合实验是一种操作简便、价格低廉，实用且有效的产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型检测方法，但不能区分同时含有丝氨酸酶和金属酶的菌株。本研究存在的不足之处在于未同时检测产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型结果相应的耐药基因，有待后续研究从基因水平进一步完善。

参考文献

[1] 尹娟，王莹超，眭阳，等. mCIM 与 eCIM 在产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌表型筛查中的价值[J]. 检验医学，2021，36（2）：177-180.

[2] 王玉洁. 耐碳青霉烯肠杆菌的临床分布与耐药性分析[J].实用医技杂志，2021，28（6）：779-780.

[3] 肖春兰，彭进展，王秋平，等. 衡阳地区某三甲医院 2017－2019 年耐碳青霉烯菌检出情况分析[J]. 湖北民族大学学报·医学版，2020,37（3）：65-68.

[4] 全国细菌耐药监测网.全国细菌耐药监测网 2014-2019 年细菌耐药性监测报告[J].中国感染控制杂志,2021,20(1):15-31.

[5]全国细菌耐药监测网.2020 年全国细菌耐药监测报告[J].中华检验医学杂志,2022,45(2):122-136.

[6]全国细菌耐药监测网.2021年全国细菌耐药监测报告[J].中华检验医学杂志,2023,46(6):566 -581.

[7] 唐克文，李娟，冯丽娜，等.mCIM 试验与 eCIM 试验在产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型检测中的联合应用效能[J].山东医药,2019,59(224):35-39.

[8] 王永红，刘 航，邹家齐，等. mCIM 与 eCIM 检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的临床评价[J]. 第三军医大学学报，2020，42(5):466-472.

[9] 吕岩，吕承秀，李庆，等.某三甲医院分离的耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌的耐药基因及其同源性[J].中华医院感染学杂志，2024，34(1):7-12.

[10] 李世荣，林怡菁，蒋晓飞，等.双浓度联合改良碳青霉烯灭活试验筛查 CRE 的临床应用价值[J].检验医学，2020，35(10)：979-982.

[11] 符梦瑜，郑裕彤，周伟全，等.产金属 β-内酰胺酶细菌的治疗药物研究进展[J].现代药物与临床，2024,39(2)：514-521.

广西卫生健康委员会自筹经费科研课题(Z20210536)