数字PCR在诊断儿童MRSA血流感染中的应用

 数字PCR在诊断儿童MRSA血流感染中的应用

叶竞争

   梁平区人民医院    405299

[摘要]目的 探讨数字聚合酶链式反应（PCR）检测儿童耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）血流感染的应用价值。方法  收集2019年4月至2024年1月在我院住院患儿的血液，采用数字PCR方法和血培养法，对患儿的MRSA血流感染情况进行检测，统计学软件选取SPSS24.0。结果  收集到180例患儿血液标本，MRSA血流感染阳性的有40份，其中血培养和数字PCR均阴性的有140份，仅培养阳性的有2份，数字PCR阳性的有6份，血培养和数字PCR均为阳性的有32份。数字PCR检测的敏感性为94.12%（32/34），特异性为95.89%（140/146），阳性预测值 84.21%（32/38），阴性预测值 98.59%（140/142）。结论  数字PCR在诊断儿童MRSA血流感染中的快捷性和灵敏度较高，特异性较好，有利于提高临床快速诊断MRSA血流感染的能力，为尽早精准治疗争取时间，进而改善患儿的预后。

【关键词】儿童；MRSA血流感染；数字PCR；血培养

  MRSA即耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，是一种在医学领域备受关注的细菌。因其独特的耐药特性，成为了医院及社区感染的主要病原菌之一，对公共卫生安全构成了严重威胁。MRSA引起的感染通常较为严重，包括皮肤感染、肺炎、尿路感染、血流感染等。这些感染不仅会导致患者的生活质量下降，还可能引发严重的并发症，甚至危及生命。因此，对于MRSA感染的预防和治疗显得尤为重要[1]。据有关调查显示[2]，如果不能尽快明确MRSA血流感染的感染原发病灶，其病死率可达40%-66%。因此，在血流感染的临床诊疗中，病原菌的明确显得尤为重要。近年来，随着抗生素的广泛使用，大大降低了细菌培养的阳性率，增加了血流感染性疾病的病原学诊断难度。数字PCR是近几年发展起来的一种核酸定量分析技术，相较于传统荧光定量PCR来说，数字PCR对结果的判定不依赖于扩增曲线循环Ct值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA的分子个数，能够对起始样本核酸分子绝对定量。因此，本研究探讨了数字PCR检测儿童MRSA血流感染的应用价值，现报道如下：

1材料与方法

1.1一般资料

收集2019年4月至2024年1月在我院住院患儿的血液标本180份，其中男性120例，女性60例，年龄2月13岁，同时所有研究对象的血液标本同时送检数字PCR及血培养检测。纳入标准：①入院温度＞38.5℃；②热程＞3d；③有明确的感染病灶；④C反应蛋白＞40mg/L。本次研究经本院医院伦理委员会的批准，研究均获得患儿监护人的知情，且签署参与协议书。

1.2方法

血培养方法：将血标本经肉汤培养后，在体积分数5%的绵羊血琼脂平板上接种，并放置在37℃的孵育箱中，放置时间18至24小时，挑选菌落，并分离、纯化可疑菌落，采用全自动微生物鉴定仪对菌株进行鉴定，剔除同一患儿的相同部位重复阳性菌株，再行药敏试验。

药敏试验：采用纸片扩散法对实验药物的抑菌圈直径进行测定，采用双纸片协同法对产超广谱β内酰胺酶菌株进行确证。

数字PCR检测方法：①采样：‌采集血液或其他无菌体液样本，‌使用游离DNA管，‌并采样5-10ml。‌②核酸提取：‌从样本中提取核酸。③芯片制备：‌将预混液（‌样品与PCR试剂）‌分配到芯片上，‌形成数百个单独的PCR反应区域。‌④PCR扩增：‌在每个反应区域进行PCR扩增，‌利用热循环和荧光检测技术。⑤结果分析：‌使用分析软件查看和分析扩增曲线，‌从而得到结果。

敏感性实验：在血平板上，挑取直径为1mm的金黄色葡萄球菌ATCC43300菌株，放置于200ul灭菌去离子水的EP管中，制备DNA提取液。稀释该提取液后取2ul扩增，该法的检测限为以仍能检出阳性的最高稀释倍数。

特异性实验：提取本院所保存的细菌基因组，包括肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌进行PCR扩增，进行特异性炎症。

1.3统计学分析

采用SPSS24.0统计软件进行数据录入和分析。计数资料以[n/%]描述，并用2检验；计量资料以均数±标准差描述，并用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1数字PCR检测和传统培养法检测结果：收集到180例患儿血液标本，MRSA血流感染阳性的有40份，其中血培养和数字PCR均阴性的有140份，仅培养阳性的有2份，数字PCR阳性的有6份，血培养和数字PCR均为阳性的有32份，详见表1。数字PCR检测的敏感性为94.12%（32/34），特异性为95.89%（140/146），阳性预测值 84.21%（32/38），阴性预测值 98.59%（140/142）。

表1  两种检测方法的阳性检出情况

3讨论

MRSA是导致重症感染常见的致病菌之一，也是临床治疗中最常见的多重耐药菌，其所致的血流感染具有较高的发病率及病死率，增加了治疗难度。据有关调查显示[3]，在因细菌感染引发的社区获得性肺炎中，MRSA感染占所有细菌感染的8.1%，占金黄色葡萄球菌的一半。MRSA对所有β-内酰胺类抗生素（包括甲氧西林在内）都产生了抗药性，如对苯唑西林和青霉素100%耐药，而青霉素是经验性抗感染治疗时最普遍使用药物，而选择这种用药方案，会使MRSA感染的最佳治疗时机延误，也会增加MRSA感染的治疗难度。目前，临床上诊断MRSA血流感染的金标准是血培养阳性，但血培养的周期相对较长，故对MRSA血流感染的早期诊断，来降低患者的死亡率，减少医院感染显得尤为重要[4]。

近年来，数字PCR正迅速成为实时荧光定量PCR进行精确核酸定量分析的值得信赖的辅助技术，因为这种技术可以在存在抑制剂的情况下提供高灵敏度和稳健性。数字PCR被应用于多种研究应用中，在罕见靶标定量分析、拷贝数变异（CNV）和基因表达等方面表现出前所未有的可信度[5]。徐卫华[6]等报道指出，数字PCR在MRSA血流感染中具有较高的敏感性和特异性，对MRSA血流感染的诊断有较高的价值。本研究收集到180例患儿血液标本，MRSA血流感染阳性的有40份，其中血培养和数字PCR均阴性的有140份，仅培养阳性的有2份，数字PCR阳性的有6份，血培养和数字PCR均为阳性的有32份。数字PCR检测的敏感性为94.12%（32/34），特异性为95.89%（140/146），阳性预测值84.21%（32/38），阴性预测值98.59%（140/142），这与上述报道结论基本相似。

综上所述，数字PCR在诊断儿童MRSA血流感染中的快捷性和灵敏度较高，特异性较好，有利于提高临床快速诊断MRSA血流感染的能力，为尽早精准治疗争取时间，进而改善患儿的预后。

参考文献：

[1]王兴梅,郭紫瑶,张茜,等.儿童MRSA血流感染血培养随访及持续感染临床预警因素分析[J].重庆医学, 2023, 52(11):1645-1650.

[2]刘京涛,张君平,彭文娟.儿童耐甲氧西林金黄色葡萄球菌血流感染的临床特征[J].河南医学研究, 2019, 28(9):1563-1565.

[3]汪洋,李思婵,宋小英,等.万古霉素治疗儿童MRSA肺炎的体内暴露量与临床疗效研究[J].中华医院感染学杂志, 2019, 29(16):2505-2509.

[4]郭瑛,韩冰,王丽,等.数字PCR技术在布鲁菌病疗效判定中的应用价值[J].河北医药, 2017, 39(15):2292-2295.

[5]沈磊,骆俊,施宏,等. 痰标本甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌培养与聚合酶链反应快速检测方法的比较［J］.中国感染与化疗杂志,2015,15(3):260-263.

[6]徐卫华,田克印,李小双.数字PCR和血培养检测儿童MRSA血流感染应用价值比较[J].中山大学学报：医学科学版, 2020, 41(6):930-936.