可用于移植的肝细胞研究进展

可用于移植的肝细胞研究进展

何同梅（综述）武一曼（审校）

何同梅（综述）武一曼（审校）（福建中医药大学350108）

【摘要】肝细胞移植作为治疗暴发性肝功能衰竭及各种终末期肝病一种潜在方法，具有创伤小、安全简单、可一肝多用、重复移植、抗原性低等优点。可以用作移植的肝细胞种类很多，目前也有很多关于这方面的报道，本文就可用于移植的肝细胞的研究进展做一简单总结。

【关键词】肝细胞移植成人肝细胞胎肝细胞永生化肝细胞卵圆细胞小肝细胞IPS细胞胚胎干细胞骨髓干细胞异种肝细胞肝癌细胞株

【中图分类号】R329.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）05-0354-03

近年来，国内外的原位肝移植技术（OLT）得到了迅速发展，已逐渐成为治疗终末期肝病的重要手段，但由于供肝来源困难、需终身应用免疫抑制剂、手术费用昂贵等诸多原因，大大限制了OLT在临床上的普及应用。而肝细胞移植逐渐在一些动物实验及临床实践中被证明对急、慢性肝功能衰竭及遗传性肝代谢疾病有较好的疗效[1,2]。相对于OLT，它避免了供肝来源困难、手术操作复杂、费用昂贵等缺点；与生物人工肝相比，肝细胞移植不需要通过体外血液循环，从而避免了体外循环所导致的严重心肺功能异常、血流动力学紊乱、消化道及其他脏器活动性出血等并发症。因此许多国内外学者对肝细胞移植进行了深入研究，并取得了一些成果，本文就可用于移植的肝细胞的研究状况作一简单介绍。

1成人肝细胞

成人肝细胞分化良好、功能完善，是肝细胞移植的一种良好选择。国内外许多专家[3,4]已经在临床中应用成人肝细胞移植这项技术，移植部位有明显的肝细胞再生现象，但这种肝再生可以支持患者存活的病例仍然比较罕见。该细胞在临床应用中主要存在以下几个问题：①提供肝细胞的供体肝资源有限。②从肝脏分离消化的肝细胞常表现为分裂和增殖异常；肝细胞通过胰蛋白酶的消化后会引起体内广泛的细胞免疫，因此体外培养肝细胞的条件比较苛刻。④冷保存损伤会加速肝细胞的凋亡，因此肝细胞的保存时间有限，不利于急性肝衰竭病例的应用。[5,6]

2胎肝细胞

与成人肝细胞相比，胎肝细胞的免疫源性相对较弱，分裂、增生能力较强，移植后细胞数量增加相对较多、迅速。目前已经有许多试验室建立了小鼠肝胚瘤细胞系，也有实验证明该细胞可以被分离并培养，并且植入小鼠体内后可以成功分化为成熟肝细胞[7,8]。由于胎肝细胞来源尚受到一定法律与伦理学的制约，难以大量发展。但若能在人胚胎肝细胞的基础上构建具有永生化的肝细胞株，则将为人胎肝细胞移植的临床应用提供广阔前景[9]。

3肝干细胞

近年来，有关干细胞的研究方兴未艾。除了胚胎干细胞、血液干细胞及神经干细胞外，肝干细胞是引人注目的研究项目之一。用于治疗肝病的肝干细胞可分为肝源性和非肝源性肝干细胞，虽然两者在形态、表面标记、功能、分化等方面有所差异，但均具有多向演变的特性[10]。

3.1肝源性肝干细胞主要包括卵圆细胞、小肝细胞、胎肝干细胞等。

3.1.1卵圆细胞（hepaticovalcellHOC）HOC由Kinosita于1937年发现，位于小叶间胆管和Hering管间。它是肝脏的干细胞，具备多向分化潜能，体内外实验证实其可以分化为肝细胞、胆管细胞、胰腺及肠型上皮细胞。在胚胎发育过程中，肝脏干细胞以肝细胞的形式存在，而在成年哺乳动物的肝组织中则以HOC的形式存在，就其分化能力而言，肝HOC属于二级干细胞，即前体细胞。以后又进一步发现肝HOC有一些高度表达的表面标志物，如OV-6，C-kit，CD34，Thy-1，并可表达甲胎蛋白(AFP)及CK19等。这些均提示HOC可能为骨髓来源。但也有试验提示为肝源性，故对于HOC的起源问题并未达成共识[11]。HOC的研究有着广泛的应用前景及临床意义，它的增殖培养及定向分化为细胞移植及生物人工肝提供新的细胞来源，而且它具有有免疫原性低、易低温保存、一个供体可以提供给多个受体等优点，解决了细胞移植和器官移植供体不足、免疫排斥的问题。实验表明HOC移植能够改善肝功能，各种急性和亚急性肝脏疾病有望通过HOC移植进行治疗。利用其进行体外基因治疗，通过体外基因修饰HOC，再移植给有相应基因缺陷的肝脏，使其转变成正常功能的肝细胞，可以用于治疗一些代谢性疾病或遗传缺陷性肝病如肝豆状核变性等，通过对HOC增殖分化与迁移的研究，有助于阐明肝癌的发生与转移机制。虽然对于HOC的研究已取得了很大的进展，但是尚有许多问题需要进一步探索：①HOC的分离和纯化及鉴别。目前还没有一种完全有效的纯化、鉴别HOC的方法，致使其作为肝细胞移植的细胞来源受到极大的限制。②HOC是如何实现定向诱导分化及调控机制，目前尚不清楚，这方面的研究将为治疗肝病提供新的理论基础。③HOC与肝癌的关系仍处于初步研究阶段，还有许多问题需要进一步探索[12]。

3.1.2小肝细胞（smallhepatocyte-likeprogenitorcellsSHPCs）SHPCs形态与成熟肝细胞类似，直径为9~12nm的小型单个核细胞，成铺路石样增殖，其性质介于肝细胞与肝管上皮细胞之间。体内SHPCs多在严重肝脏损伤（如病毒性肝炎患者、爆发性肝衰竭患者、肝硬化及肝大部分切除患者和D氨基半乳糖诱导的肝衰竭动物模型）情况下增殖。HE等[13]研究证明HOC先变成SHPCs，再分化成肝细胞，可通过形态学（细胞核呈圆形，多核）和缺少CK-19mRNA表达与HOC相鉴别。BestDH[14]等也证实了SHPCs在肝细胞坏死因子的刺激下可以再生。

3.2非肝源性肝干细胞包括诱导性多能干细胞（InducedPluripotentStemCells.IPSs）、胚胎干细胞、骨髓干细胞及脂肪干细胞等不同来源的肝脏干细胞。

3.2.1IPS细胞IPSs细胞最初是日本人ShinyaYamanaka[15]于2006年利用病毒载体将四个转录因子（Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重新编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。由于培育IPSs细胞无需借助胚胎，且可以来源于患者自体细胞，所以可避免肝细胞的伦理问题及免疫排斥问题，因此该细胞有望成为治疗肝病的又一重要细胞来源。Si-TayebK[16]等发现来源于IPSs的肝细胞可以分泌人血白蛋白、合成尿素及表达人细胞色素P450酶。RashidST等[17]认为来源于患者IPSs的肝细胞有很多潜在功能，其中包括组织代替治疗及基因治疗。但这些研究都不成熟，距离真正应用于临床还有很长的路。

3.2.2胚胎干细胞胚胎干细胞是增殖能力最强的全能干细胞，是一种高度未分化细胞，能诱导分化为三个胚层的各种细胞。Baharvand等[18]将人胚胎干细胞置于三维胶原培养系统中，并加入外源性生长因子定向诱导，结果显示分化后的胚胎干细胞成功表达了各种肝细胞的特异性标记物，电子显微镜下可见肝细胞样的超微结构。Yamamoto等[19]证实胚胎干细胞移植能显著改善CCl4诱导的肝损伤。Teratani等[20]报道胚胎干细胞在诱导因子作用下可直接分化为有功能的成熟肝细胞，将其移植入小鼠肝损伤模型体内后发现移植细胞弥散分布至损伤的肝内且大量增殖。然而，由于胚胎干细胞是全能干细胞，很难确保其完全定向分化为肝细胞，且移植后可能形成肿瘤如畸胎瘤[21]，因此短期内很难应用于临床。

3.2.3骨髓干细胞骨髓干细胞是肝细胞的重要肝外来源，在特定的条件下可分化为肝细胞，从而参与肝功能的修复和重建，是肝细胞移植中研究最多的细胞。骨髓干细胞包括间充质干细胞和造血干细胞。骨髓干细胞在体内、外分化为肝细胞的实验研究已趋于成熟。①体外分化实验：细胞因子和生长因子如肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α、白介素-6及肿瘤坏死因子-l等在肝脏的发育和再生过程中起重要的作用，单独和联合应用会在体外诱导骨髓干细胞增殖并向肝系细胞分化[22]。②体内分化试验：直接将骨髓中干细胞移植到肝脏，在肝损伤微环境调节下可分化为肝细胞。Cai等[23]在实验中发现“病理微环境”在干细胞的体内横向分化中十分重要。所以提倡利用胆固醇血清培养骨髓干细胞。Avita等[24]实验得到在含有胆固醇的培养体系中β2m-/Th1+细胞可分化为成熟肝细胞,且具有代谢氨和尿素的功能。另外，部分肝切除、全身杀伤性放射、CCL4诱导的肝硬化等刺激肝再生的环境存在下，在动物体内成功诱导骨髓干细胞向肝细胞转化也已得到了证实。

3.2.4脂肪干细胞（humanadipose-derivedstemscellshASCs）hASCs是位于脂肪组织内的间充质干细胞，有自我修复及向多种细胞分化的功能，在组织受损伤可以分泌多种细胞因子及生长因子。目前已有专家[25]通过动物实验将hASCs诱导成内胚层细胞，并且获得肝细胞的一些特点如多边形、合成白蛋白、分泌多种酶蛋白等。迄今有关肝干细胞研究仍主要集中在基础及应用基础方面，但其潜在应用前景十分巨大。

4永生化肝细胞

近来一种新型的永生化肝细胞株NKNT-被应用于肝细胞移植，包括SV40LT基因及HSV-TK等多种控制基因的逆转录病毒载体转染肝细胞，经筛选培养可获得NKNT-3细胞株，选择分化高、功能最接近正常的NKNT-3永生化肝细胞株移植，通过自杀基因Hygro-TK的表达来杀灭瘤细胞或Cre重组酶剪除位于LoxP靶点之间的SV40LTs基因,使增殖后的永生化肝细胞恢复正常，为一较为理想的肝细胞移植供体[26]。但由于肝细胞永生化的同时涉及癌基因的表达，因此治疗的安全性受到一定的质疑。如何更好控制永生化肝细胞的致瘤性，稳定体外永生化肝细胞的表型，以及提高肝细胞的分化功能等都将是今后永生化研究的热点。

5异种肝细胞

一般包括猪、兔、鼠等的肝细胞，其中以猪肝细胞应用最为广泛，效果也最为可靠，其解剖和生理与人类近似，且来源丰富，易大量获取肝细胞，体外培养及体内实验均表明猪肝细胞能提供一定的肝功能。但猪肝细胞存在一定的局限性，如免疫问题、猪肝细胞的生理功能有限性、感染人畜共患疾病(如猪内源性逆转录病毒)可能性及生命伦理学问题等[27,28]。

6肝癌细胞株

肝癌细胞也具有一定的生物合成、代谢、转化等功能，在体外生物人工肝脏的研究中它可能具有重要的应用价值[29,30]。但是，将肝癌细胞或肝癌细胞株直接植入人体可能具有很大的风险，特别是肝癌细胞有可能无限制生长形成癌瘤和扩散。不过，有人认为如果将肝癌细胞包被于生物膜内可以避免这一风险，有待验证。

综合目前研究成果，肝细胞移植所选细胞应具有以下几大特性：①来源广泛；②分离、纯化简单；③能持续增殖并稳定表达成熟肝细胞特性；④能降低或避免免疫排斥反应；⑤无社会伦理问题。相信随着对肝细胞研究的不断深入，一定能研究出合适的细胞应用于临床，使得肝细胞移植成为治疗终末期肝病的主要手段。

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