（十堰市太和医院生殖医学中心湖北十堰442000）【摘要】目的：探究肺癌细胞分泌的外泌体对顺铂的敏感性调节。方法：通过超速离心从肺癌细胞A549上清液中分离得到外泌体，采用透射电子显微镜（TEM）来观察外泌体的形貌，蛋白质印迹法检测CD63和CD81的蛋白表达；将肺癌细胞来源外泌体一组用顺铂处理，另一组不进行处理，将2组外泌体与肺癌细胞共同培养，然后用CCK-8法来检测外泌体在同源细胞中对顺铂的敏感性调节过程中的作用。结果：外泌体在透射电子显微镜下观察到具有盘状的形貌，直径约30-100nm；蛋白质印迹法显示外泌体富含CD63和CD81蛋白；未顺铂处理的exosome干预细胞组较PBS处理的细胞组细胞存活率高4%，而顺铂处理的exosome干预细胞组较未顺铂处理的exosome干预细胞组细胞存活率高24%，P<0.05。结论：肺癌细胞来源的顺铂处理的外泌体降低了肺癌细胞对顺铂的敏感性，这可能为肺癌的化疗提供一种新的靶点和思路。【关键词】肺癌；外泌体；化疗【中图分类号】R197【文献标识码】A【文章编号】1004-7484（2019）02-0091-02Lungcancercell-derivedcisplatin-treatedexosomesreducethesensitivityoflungcancercellstocisplatinYangyiZhangzhijun（Correspondingauthor）（Centerforreproductivemedicine,Taihehospital,Shiyan442000,Hubei,China）【Abstract】Objective：Toinvestigatethesensitivityofexosomessecretedbylungcancercellstocisplatin.Methods：ExosomeswereisolatedfromthesupernatantoflungcancercellA549byultracentrifugation.Themorphologyofexosomeswasobservedbytransmissionelectronmicroscopy(TEM).TheproteinexpressionofCD63andCD81wasdetectedbyWesternblotting.Onegroupwastreatedwithcisplatinandtheothergroupwasnottreated.Twogroupsofexosomeswereco-culturedwithlungcancercells,andthenCCK-8methodwasusedtodetectthesensitivityofexosomestocisplatininhomologouscells.Theroleoftheadjustmentprocess.Results：Exosomeswereobservedtohaveadisk-likemorphologyundertransmissionelectronmicroscopywithadiameterofabout30-100nm.WesternblottingshowedthatexosomeswererichinCD63andCD81proteins.Thenon-cisplatin-treatedexosomeinterventioncellgrouphada4%highercellviabilitythanthePBS-treatedcellgroup,whilethecisplatin-treatedexosomeinterventioncellgrouphada24%highercellviabilitythanthenon-cisplatin-treatedexosomeinterventioncellgroup,P<0.05.Conclusion：Lungcancercell-derivedcisplatin-treatedexosomesreducethesensitivityoflungcancercellstocisplatin,whichmayprovideanewtargetandideaforchemotherapyoflungcancer.【Keyword】Lungcancer;Exosome;Chemotherapy肺癌的发病率和致死率在所有恶性肿瘤中居于首位，并且逐年上升，严重危害着人民健康。肺癌起病隐匿，病情发展迅速，影响肺癌预后的最主要因素是分期，约75%~85%的肺癌患者在诊断时就已属晚期，失去彻底切除机会[1-3]。外泌体(exosome，Exo)是由多种细胞如树突状细胞、肿瘤细胞等经内吞逆出芽形成许多小囊泡，直径约30~100nm。它可以在不直接接触的情况下完成细胞间生物信号传导[4]。本研究成功从肺癌细胞中提出外泌体，并揭示了肺癌细胞来源的外泌体能调节肺癌细胞对顺铂化疗敏感性，这为肺癌的治疗提供了一种新的思路和靶点1资料与方法1.1细胞培养肺癌细胞A549购于上海细胞库。将其接种到培养液中37℃、5%CO2的恒温箱内150rpm培养，培养48h传代一次。培养液成分：RPMI1640培养液中添加10U/L庆大霉素和10%灭活胎牛血清。1.2提取exosomes、电镜制样和检测蛋白表达收集培养48h后的培养液上清液，将上清液用离心机多次离心去除胞体和碎片杂质，取浓缩液，在4℃下继续离心得到的下层沉淀即是exosomes。将得到的exosomes沉淀溶解稀释，取20ul滴到铜网，室温下晾干，即可置于透射扫描电镜下进行观察并拍摄照片。1.3CCK-8法检测细胞的存活率将A549肺癌细胞（对数生长期）接种到96孔板中(细胞数约6×103个/孔)，24h后加入不同浓度梯度的顺铂(浓度为0-10μg/ml)，培养48h。每孔加入100ul1:9的CCK-8和培养液，30min后，用紫外可见光分光仪在450nm波长下测吸光度。1.4统计学方法所有数据均采用SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料应用平均值±标准差()，计量资料组间比较采用对照组独立样本t检验，计数资料以百分率（%）表示，采用x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1肺癌细胞A549来源exosomes形态和蛋白表达图1肺癌细胞A549来源exosomes形态（A）和蛋白表达（B）从透射显微电镜图中可以达到Exosome的形态为圆盘状（图1A），直径约为30-100nm，大小尺寸为纳米级。从图1B中可以发现具有特异性表达CD63和CD81蛋白，这证明我们提取的是细胞分泌到细胞外的exosomes，而不是其他物质，提取成功。2.2exosome对顺铂敏感性调解过程中的影响图2不同梯度浓度顺铂处理48h后的细胞存活率不同浓度梯度的顺铂对肺癌细胞有一定的抑制作用，浓度越大，细胞存活率就越低，在3ug/ml的顺铂浓度时，细胞存活率为50%（图2）。分别用顺铂处理过的exosome和顺铂处理的exosome预处理细胞，并与对照PBS组作比较（图3）。未顺铂处理的exosome干预细胞组较PBS处理的细胞组细胞存活率高4%，而顺铂处理的exosome干预细胞组较未顺铂处理的exosome干预细胞组细胞存活率高24%。注：1：PBS处理的细胞组；2：未顺铂处理的exosome干预细胞组；3：顺铂处理的exosome干预细胞组。图3.在3ug/ml顺铂浓度下A549细胞存活率3讨论自1987年，Johnstone等首次观察到外泌体，成功分离纯化并命名为exosomes之后，外泌体的研究引起了广泛的关注。2001年，有研究发现，肿瘤来源的外泌体(tumor-derivedexosome，TEX)表面富含肿瘤抗原，可使细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)主动杀伤肿瘤细胞[5]。由此，Exo在肿瘤领域的研究逐渐推上了热潮。Exo也被看作是一种热休克蛋白的载体，热休克蛋白（Hsp）可在各种应激状态下被诱导，作为一种“危险信号”诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，又称为应激蛋白[6]。此研究显示，抑制肺癌细胞Exo的生成或释放将为肺癌的治疗提供新的方法。本研究通过透射电子显微镜观察到了肺癌细胞A549分泌的exosome的形态为圆盘状，蛋白质印迹法也顺利检测到CD63和CD81两种特异性蛋白质。CCK-8法检测到的细胞成活率明显经顺铂处理组要比未经顺铂处理组要高。这说明exosome会影响同源细胞对顺铂敏感性有所降低，不利于癌症患者顺铂化疗的治疗。综上所述，肺癌细胞分泌的exosome可以在细胞间传递信息，导致同源细胞对顺铂敏感性的降低。换句话说，减少exosome的分泌和细胞间的传递可以增加顺铂化疗的敏感性和疗效，可以在治疗肺癌药物研究中加以应用，是一种新的治疗思路。参考文献[1]M.J.Tsai,etal.Cysteinylleukotrienereceptorantagonistsdecreasecancerriskinasthmapatients.Sci.Rep.6(2016),23979.[2]KOSAKAN.Decodingthesecretofcancerbymeansofextracellularvesicles[J].JClinMed,2016,5(2):22.[3]AnaLukic,CasperJ.E.Wahlund,CristinaGómeza,DanielBrodin,BengtSamuelsson,CraigE.Wheelock,SusanneGabrielssonb,OlofRådmark.ExosomesandcellsfromlungcancerpleuralexudatestransformLTC4toLTD4,promotingcellmigrationandsurvivalviaCysLT1.CancerLetters.2019,444,1-8.[4]LiZhou,Tangfeng,LvQunZhang,QingqingZhu,PingZhan,SuhuaZhu,JianyaZhang,YongSong.Thebiology,functionandclinicalimplicationsofexosomesinlungcancerCancerLetters,2017,407,84-92.[5]解世林,曲晶磊,范一博,等.Akt和SRC在Exosomes促进同源肺癌细胞迁移中的作用[J].中国医科大学学报,2017,46(04):294-297.[6]Y.Liu,etal.TumorexosomalRNAspromotelungpre-metastaticnicheformationbyactivatingalveolarepithelialTLR3torecruitneutrophils,CancerCell.2016,30(2):243–256.十堰市科技局项目项目名称：Exosomes对肺癌发生发展的影响和机制的研究（项目编号：18Y40）
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