简介:摘要目的确定致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)LA2404基因产物为Sigma N转录因子,鉴定Sigma N信号系统参与调控的下游靶基因。方法采用生物信息学软件并根据Sigma N调控基因启动子序列特征,预测并分析钩体基因组中LA2404基因及其调控的靶基因。采用等位交换原理构建问号钩体LA2404基因敲除株(ΔLA2404)。采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测ΔLA2404敲除株中候选靶基因mRNA水平变化。构建LA2404基因原核表达系统并提纯目的重组蛋白(rSigma N)。采用凝胶迁移试验(gel electrophoresis mobility shift assay, EMSA)验证Sigma N调控的靶基因。结果致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株有一个Sigma N编码基因以及22个含Sigma N启动子序列的靶基因。ΔLA2404敲除株有钩体典型、活泼的运动方式,外形无明显变化。ΔLA2404敲除株中LA1188、LA2306、LA3426、LA1968、LA1313、LA3806和LA0773基因mRNA水平显著下调(P<0.05),其他靶基因mRNA水平无明显变化。EMSA结果显示,rSigma N可与上述靶基因启动子序列结合。结论LA2404基因产物为Sigma N调控基因。LA1188、LA2306、LA3426、LA1968、LA1313、LA3806和LA0773的启动子序列能与转录因子Sigma N结合,上述7个基因表达受Sigma N通路调控。
简介:摘要目的探讨问号钩端螺旋体(简称钩体)跨血管内皮细胞转运分子机制。方法采用Transwell法了解问号钩体赖株穿越人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)单层能力。采用透射电镜和激光共聚焦显微镜法检测HUVEC内吞问号钩体后形成内吞泡情况。采用细胞内吞抑制试验确定HUVEC内吞问号钩体方式。采用激光共聚焦显微镜法检测HUVEC胞内问号钩体与溶酶体标志分子LAMP1共定位情况。采用暗视野显微镜Petroff-Hausser计数法检测HUVEC胞内问号钩体出胞情况。结果问号钩体赖株能迅速穿越HUVEC细胞单层。问号钩体通过PI3K-微丝依赖的细胞内吞方式进入HUVEC并形成内吞泡。HUVEC胞内问号钩体不与LAMP1共定位,提示问号钩体内吞泡不与溶酶体融合。HUVEC胞内问号钩体通过FAK-微丝/微管途径出胞。结论问号钩体通过跨细胞转运方式穿越人血管内皮细胞导致体内播散并加重病情。
简介:摘要目的确定问号钩端螺旋体vWF-A基因产物结合人胶原蛋白的作用与机制。方法采用生物信息学软件分析问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株vWF-A基因(LA_0012、LA_0697和LA_4207)产物结构与功能。构建上述基因vWF-A功能结构域片段原核表达系统,采用SDS-PAGE和Ni-NTA亲和层析法检查目的重组蛋白rLep0012、rLep0697和rLep4207表达情况和提纯效果。采用ELISA和表面等离子共振法(SPR)检测目的重组蛋白与人Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原蛋白(hCOL1/3/4/6)的结合能力。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测问号钩端螺旋体赖株感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)时vWF-A基因转录和表达水平变化。结果vWF-A基因产物均为含vWF-A超家族结构域表面或跨膜蛋白,但LA_0697和LA_4207基因还含有金属离子依赖性黏附位点(MIDAS)。所构建的原核表达系统能有效表达目的重组蛋白,Ni-NTA亲和层析法提纯后SDS-PAGE检测均显示为单一蛋白条带。ELISA结果显示rLep0697与hCOL3/6、rLep4207与hCOL1/4呈强结合。SPR结果显示rLep0697快速结合hCOL3/6但快速解离(KD值=5.71×10-8和5.89×10-8 mol/L),rLep4207快速并稳定结合hCOL1/4(KD值=6.4×10-9和3.2×10-9 mol/L)。感染HUVEC和EOMA细胞时,上述vWF-A基因转录和表达水平均显著升高(P<0.05)。结论LA_0697和LA_4207基因产物可作为问号钩端螺旋体感染过程中的黏附因子。
简介:摘要目的探讨问号钩端螺旋体溶血素Sph2经高迁移率组蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)放大炎症反应的可能机制。方法一定浓度的rSph2与小鼠J774A.1巨噬细胞共孵育一定时间,乳酸脱氢酶(LDH)量的变化检测细胞的膜结构损伤情况;冷冻电镜观察细胞结构的改变;ELISA方法检测细胞上清液中HMGB1的含量变化。商品化的HMGB1与小鼠J774A.1巨噬细胞共孵育一定时间,Western blot检测NF-κB、p38-MAPK及JNK炎症信号通路关键分子的磷酸化水平;ELISA检测IL-1β、IL-6、KC(IL-8)等促炎细胞因子的表达情况。结果重组问号钩端螺旋体溶血素rSph2可导致J774A.1细胞明显的细胞核消失、细胞膜结构损伤、细胞裂解、膜泡胀;LDH释放量及HMGB1的含量明显增加;HMGB1增加NF-κB、p38-MAPK及JNK信号通路关键蛋白质的磷酸化水平;HMGB1上调J774A.1细胞IL-1β、IL-6、KC的表达且该上调作用可被3条通路抑制剂所抑制。结论重组问号钩端螺旋体溶血素rSph2诱导小鼠J774A.1巨噬细胞产生损伤并释放大量的HMGB1,HMGB1经NF-κB、p38-MAPK及JNK信号通路调控下游促炎细胞因子的表达,从而放大rSph2造成的炎症效应。
简介:摘要目的讨论神经系统钩端螺旋体病的诊断。方法根据患者临床表现结合检查结果进行诊断并鉴别。结论用已知抗原检测血中抗体-红细胞凝集试验、凝溶试验、补体结合试验、炭凝集试验。脑脊液、血液中可分离出螺旋体。
简介:目的探讨钩端螺旋体病(钩体病)流行规律。分析存在问题。方法用MAT法检测病人、水鸭和蛙血清抗体;同时分离培养病原体。用夹夜法捕鼠,采集鼠肾,猪肾,牛中段尿,蛙肾、水鸭肾和蚂蝗血分离培养病原体。结果1997-2000年全省共发生钩体病789例,平均发病率为0.44/10万,死亡12人,平均病死率为1.52%。衢州、丽水和台州市的发病数占全省发病总数的93.28%。病例主要分布在7-10月,占95.06%,病人血清抗体阳性率为65.43%,菌群主要为黄疸出血群和七日热群。病人血培养阳性率为1.20%。鼠密度为5.08%,以黑线姬鼠为优势种,占47.34%,鼠带菌率为6.90%,黑线姬鼠带菌率为13.19%,蛙肾阳性率为0.17%。水鸭血清抗体阳性率为50%,菌株主要为秋季群;蛙血抗体阳性率为13.64%,菌株为秋季群。结论钩体病防制工作不能放松。要加强对该病的监测和防治工作。